Un microorganismo recombinante de la familia Enterobacteriáceas que contiene un ORF yaaU sobreexpresado que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto,

en el cual la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica al menos en un 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8

Proceso para preparación de L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia Enterobacteriáceas.

Esta invención se refiere a un proceso para preparación de L-lisina, L-valina y L-treonina, que utiliza cepas recombinantes de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual el marco de lectura abierto (ORF) designado yaaU está sobreexpresado, y a dichos microorganismos.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, muy particularmente, en nutrición animal.

Es sabido que los L-aminoácidos se pueden preparar por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están realizándose continuamente esfuerzos para mejorar los métodos de preparación. Las mejoras metodológicas pueden referirse a medidas relacionadas con la tecnología de la fermentación, tales como la agitación o el suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutrientes, tales como la concentración de azúcar durante la fermentación, o el acabado de la forma del producto, por ejemplo por medio de cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de eficiencia del microorganismo propiamente dicho.

Para la mejora de las propiedades de eficiencia de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. Esto da por tanto como resultado cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV), o auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora, y producen L-aminoácidos tales como L-treonina.

Desde hace unos cuantos años, se han utilizado también métodos de DNA recombinante para la mejora de las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriáceas por amplificación de genes individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigación del efecto sobre la producción. Información recopilada sobre la biología celular y biología molecular de Escherichia coli y Salmonella puede encontrarse en Neidhardt (ed): Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd edition, ASM Press, Washington, D.C., USA, (1996).

Los documentos D1-D3 describen las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo con SEQ ID NO: 4, 6 y 8 de la presente solicitud, respectivamente.

Los documentos D4 WO 03/076637A y (D5) WO 03/008600A describen métodos para la producción de L-treonina por medio de sobreexpresión o deleción de ciertos genes.

El problema a resolver en (D4) está considerado como la provisión de un método para preparación de L-treonina por fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que comprenden un gen pepB sobreexpresado.

Objeto de la invención

El objeto de esta invención es proporcionar nuevas medidas para mejorar la preparación de L-aminoácidos, en particular L-treonina.

Descripción de la invención

La invención se refiere a microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que contienen un ORF yaaU sobreexpresado, que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto, y que producen L-lisina, L-valina o L-treonina, de una manera mejorada.

En cada caso, se utilizan como punto de partida para la comparación los microorganismos que no son recombinantes para el ORF yaaU, y que no contienen cantidad alguna de ORF yaaU sobreexpresado.

Estos microorganismos recombinantes incluyen, en particular, microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 90%, en particular al menos 95%, preferiblemente al menos 98%, al menos 99%, de modo particularmente preferible 99,7% y de modo muy particular preferible 100%, idéntico a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8 está sobreexpresado.

Se da preferencia a secuencias de aminoácidos que son idénticas a las de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8.

Dichos microorganismos contienen polinucleótidos sobreexpresados seleccionados del grupo:

codificando los polinucleótidos un transportador de azúcar supuesto.

La invención se refiere también a un proceso para preparar por fermentación L-lisina, L-valina o L-treonina, utilizando microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas que, en particular, producen ya dichos L-aminoácidos y en los cuales al menos el marco de lectura abierto (ORF) que tiene la designación yaaU, o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico, está o están sobreexpresados.

Se da preferencia a la utilización de los microorganismos que se describen.

Cuando se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenil-alanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-arginina and L-homoserina. Se prefiere particularmente L-treonina.

En este contexto, el término "intensificación" describe el aumento, en un microorganismo, de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas que están codificadas por el DNA correspondiente, estando incrementado, por ejemplo, el número de copias del gen o genes, o del ORF o los ORFs, al menos en una (1) copia, haciéndose uso de un promotor fuerte enlazado operativamente al gen o de un gen o alelo u ORF que codifica una enzima o proteína correspondiente que tiene una actividad alta, y combinándose estas medidas en caso apropiado.

Un segmento de una secuencia de nucleótidos que codifica, o puede...

1. Un microorganismo recombinante de la familia Enterobacteriáceas que contiene un ORF yaaU sobreexpresado que codifica un polipéptido que está apostillado como un transportador de azúcar supuesto, en el cual la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica al menos en un 90% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8.

2. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque contiene un polinucleótido sobreexpresado yaaU que se selecciona del grupo:

3. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido posee una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 95% a una de las secuencias seleccionadas del grupo SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8.

4. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido posee la secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100% a la de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 o SEQ ID No. 8.

5. Un microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se produce por transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene dicho ORF yaaU, un alelo de este ORF, o partes del mismo, y/o un promotor.

6. Un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 5, en el cual el número de copias del ORF yaaU o los alelos se ha incrementado al menos en 1.

7. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el aumento en el número de copias de dicho ORF yaaU en al menos 1 se consigue por integración de dicho ORF o los alelos del mismo en el cromosoma del microorganismo.

8. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el aumento en el número de copias de dicho ORF yaaU en al menos 1 se consigue por medio de un vector que se replica extracromosómicamente.

9. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque:

10. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho polinucleótido yaaU se halla bajo el control de un promotor que intensifica la expresión del gen.

11. El microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la intensificación del ORF yaaU aumenta la concentración o actividad del producto (proteína) del gen yaaU al menos en un 10%, basada en la actividad o concentración del producto del gen en la cepa o microorganismo parental no recombinante para el ORF yaaU.

12. El microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque otros genes del camino metabólico para la biosíntesis del L-aminoácido deseado están presentes también en forma sobreexpresada.

13. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia.

14. El microorganismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque produce L-treonina.

15. Un proceso para preparar L-aminoácidos seleccionados del grupo L-treonina, L-valina y L-lisina por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriáceas, caracterizado porque

16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque, para el propósito de preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más de los genes seleccionados del grupo:

está(n) adicionalmente sobreexpresados al mismo tiempo.

17. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque se hace uso de microorganismos en los cuales los caminos metabólicos que reducen la formación de dicho L-aminoácido están al menos parcialmente atenuados.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque, para el propósito de preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más de los genes seleccionados del grupo:

está/están atenuados adicionalmente al mismo tiempo, en particular eliminados, o su expresión está reducida.