Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos,

uso de un dispositivo microelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento.La presente invención se refiere a un procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que está basado en la técnica de la resonancia del plasmón superficial que tiene lugar sobre la superficie de material conductor de un dispositivo sensor óptico, que también se refiere a un dispositivo micro-electrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento y al uso de dicho dispositivo micro-electrónico sensor para detectar y/o cuantificar dichos bacteriófagos

Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos, uso de un dispositivo microelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento.

La presente invención se refiere a un procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que está basado en la técnica de la resonancia del plasmón superficial que tiene lugar sobre la superficie de material conductor de un dispositivo sensor óptico.

También se refiere a un dispositivo micro-electrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento y al uso de dicho dispositivo micro-electrónico sensor para detectar y/o cuantificar dichos bacteriófagos.

Antecedentes de la invención

Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias, que están formados por ácidos nucleicos (ADN o ARN) envueltos por una cápside proteica. Estos virus presentan una elevada especificad por las bacterias que infectan de manera que se puede detectar un determinado bacteriófago o grupo de bacteriófagos en función de la cepa huésped seleccionada.

De manera resumida, el ciclo de los bacteriófagos consta de 4 fases: en un primer paso se produce el reconocimiento bacteriófago-bacteria y la inyección de los ácidos nucleicos fágicos que contienen la información genética necesaria para la formación de nuevos bacteriófagos. A continuación, el material genético de los bacteriófagos se integra en forma de ADN en el cromosoma bacteriano. Una vez integrado, la infección de la célula huésped puede provocar dos tipos de respuesta en función del tipo de bacteriófago que la infecta. Así, se distinguen los bacteriófagos atemperados, que pueden integrarse en el genoma de la célula huésped indefinidamente o hasta que se induce la lisis por diversos factores, y los bacteriófagos líticos, los cuales tras un periodo de incubación y gracias a la maquinaria biosintética de la célula huésped, replican el material necesario para la creación de nuevos viriones y salen al exterior mediante la lisis de la célula huésped.

La detección y/o cuantificación de bacteriófagos de bacterias entéricas resulta de particular importancia en el control microbiológico de aguas y en la determinación del origen de la contaminación fecal. Dichos bacteriófagos han sido propuestos como microorganismos indicadores de la presencia de virus ya que tienen un comportamiento similar a éstos. Existen tres grupos de bacteriófagos de bacterias entéricas que se emplean como indicadores de contaminación fecal de origen vírico: los colífagos somáticos, fagos RNA F-específicos, y fagos que infectan bacterias Bacteroides spp.

Otro grupo de bacteriófagos cuya detección y/o cuantificación resulta de particular interés, es el formado por los bacteriófagos que infectan bacterias lácticas del tipo de las que se emplean para la producción de quesos u otros productos fermentados de tipo láctico. Dichos bacteriófagos afectan seriamente a la producción de ácido láctico lo que conlleva cuantiosas pérdidas económicas en las industrias lácticas.

Los métodos clásicos para la detección de bacteriófagos se basan en la detección de sus efectos sobre sus bacterias huéspedes. Tradicionalmente para la enumeración de los bacteriófagos se utiliza el ensayo de la doble capa de agar, en el que se deposita una capa de agar semi-sólido que contiene una cepa huésped determinada (en función del bacteriófago que se quiera cuantificar) y la muestra a analizar, sobre una capa de agar. La cuantificación de los bacteriófagos se realiza mediante la detección de zonas o placas de lisis originadas por la infección y lisis de la bacteria huésped por un bacteriófago o grupos de bacteriófagos presentes en la muestra, tras un periodo de incubación de dicha cepa huésped.

Los métodos basados en la siembra en placas presentan el inconveniente de que son muy lentos, puesto que requieren como mínimo 24 de incubación.

Otros métodos más recientemente descritos para la detección de bacteriófagos se basan en la detección de dichos bacteriófagos mediante la técnica PCR. Sin embargo, estos métodos son caros y, además, muy laboriosos.

Las patentes europeas EP0149383 y EP0714450 describen otros métodos para detectar bacteriófagos, en concreto para la detección de bacteriófagos de bacterias lácticas.

La patente EP0714450 se refiere a la detección de algún componente interno de la bacteria tras su lisis mediante la emisión de bioluminiscencia, en reacciones enzimáticas catalizadas por enzimas como la luciferaza, mientras que la patente EP0149383, se refiere a la detección de la inhibición del crecimiento mediante el uso de indicadores de pH para detectar la actividad microbiana.

Los métodos descritos en las citadas patentes presentan el inconveniente de que no permiten la detección de los bacteriófagos en estado activo, por lo que resultan en la práctica muy poco fiables.

Por otro lado, se trata de métodos muy complejos y caros, puesto que conllevan el uso de un gran número de reactivos.

Descripción de la invención

Un primer objetivo de la presente invención es el de desarrollar un procedimiento y sistema alternativo para detectar y/o cuantificar bacteriófagos, que está basado en el uso de un dispositivo sensor óptico que emplea la técnica de la Resonancia de Plasmón Superficial, en adelante técnica SPR.

De acuerdo con este objetivo, según un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que comprende las etapas de;

a) adherir bacterias procedentes de por lo menos una de dichas cepas huésped, a la superficie de material conductor de un dispositivo micro-electrónico sensor óptico basado en la técnica de la resonancia de plasmón superficial,

b) exponer las bacterias adheridas a dicha superficie, a una solución del material a analizar susceptible de contener bacteriófagos,

c) incubar la solución procedente de la etapa b) en condiciones predeterminadas al objeto de que, si las bacterias adheridas a la superficie de material conductor del sensor son infectadas por bacteriófagos, se lleve a cabo la lisis de dichas bacterias,

d) medir el ángulo de resonancia de la luz incidente sobre el sensor, mientras se lleva a cabo la incubación de la etapa c), al objeto de detectar el cambio en el ángulo de resonancia producido por la lisis bacteriana.

Atendiendo al mismo objetivo, según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que comprende un dispositivo micro-electrónico sensor óptico basado en la técnica de la resonancia de plasmón superficial, bacterias de dicha cepa huésped, adheridas a la superficie de material conductor de dicho dispositivo, y medios de procesamiento y control para detectar el cambio en el ángulo de resonancia de la luz incidente sobre el sensor, siendo producido dicho cambio por efecto de la lisis, al ser dichas bacterias infectadas y lisadas por dichos bacterió- fagos.

Un segundo objetivo de la presente invención es el de proporcionar un dispositivo micro-electrónico sensor óptico basado en la técnica de la resonancia de plasmón superficial, que comprende bacterias adheridas a la superficie de material conductor del sensor, perteneciendo dichas bacterias a por lo menos una cepa huésped predeterminada, seleccionada para ser infectada por bacteriófagos de especificidad predeterminada a dicha cepa.

Por último, un tercer objetivo de la presente invención es la utilización de un dispositivo micro-electrónico sensor óptico para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, mediante resonancia de plasmón superficial.

En la presente invención, por dispositivo micro-electrónico se entenderá un componente sensor plano, preferentemente fabricado con tecnologías microelectrónicas de capa delgada.

Por material conductor se entenderá cualquier material conductor, preferentemente, metales, pero también, óxidos conductores dopados.

De igual modo, por técnica de resonancia de plasmón superficial se entenderá la técnica... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que comprende las etapas de;

a) adherir bacterias procedentes de por lo menos una de dichas cepas huésped, a la superficie de material conductor (1a) de un dispositivo micro-electrónico sensor óptico (1) basado en la técnica de la resonancia de plasmón superficial,

b) exponer las bacterias (2) adheridas a dicha superficie, a una solución del material a analizar susceptible de contener bacteriófagos,

c) incubar la solución de la etapa b) en condiciones predeterminadas al objeto de que, si las bacterias (2) adheridas sobre la superficie de material conductor (1a) son infectadas por bacteriófagos, se lleve a cabo la lisis de dichas bacterias (2),

d) medir el ángulo de resonancia de la luz incidente sobre el sensor (1), mientras se lleva a cabo la incubación de la etapa c), al objeto de detectar el cambio en el ángulo de resonancia producido por la lisis bacteriana.

e) determinar la concentración de bacteriófagos de la solución, en función del tiempo transcurrido para detectar el cambio en el ángulo de resonancia, mediante la correspondiente curva de calibración que correlaciona el tiempo de detección del cambio con la concentración de bacteriófagos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la adhesión bacteriana de la etapa a) comprende la adsorción previa sobre dicha superficie de material conductor (1a), de material químico o biológico destinado a inmovilizar las bacterias (2) sobre el sensor (1).

3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el material conductor (1a) es oro.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 donde las bacterias (2) son bacterias biotiniladas.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 donde dichos bacteriófagos son colífagos somáticos o bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de Escherichia coli.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 donde dichos bacteriófagos son bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de bacterias lácticas.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la solución de material a analizar procede de una muestra de material líquido o material solubilizado en un líquido.

8. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la solución de material a analizar procede de una muestra de agua.

9. Sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, que comprende un dispositivo micro-electrónico sensor (1) óptico basado en la técnica de la resonancia de plasmón superficial, bacterias (2) de dicha cepa huésped, adheridas a la superficie de material conductor (1a) de dicho dispositivo (1), y medios de procesamiento y control para detectar el cambio en el ángulo de resonancia de la luz incidente sobre el sensor (1), siendo producido dicho cambio por efecto de la lisis, al ser dichas bacterias (2) infectadas y lisadas por dichos bacteriófagos.

10. Sistema según la reivindicación 9 donde el material conductor (1a) es oro.

11. Sistema según la reivindicación 9 donde las bacterias (2) son bacterias biotiniladas.

12. Sistema la reivindicación 9 donde dichos bacteriófagos son colífagos somáticos o bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de Escherichia coli.

13. Sistema según la reivindicación 9 donde dichos bacteriófagos son bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de bacterias lácticas.

14. Sistema según la reivindicación 9 en e! que la solución de material a analizar procede de una muestra de material líquido o material solubilizado en un líquido.

15. Sistema según la reivindicación 9 en el que la solución de material a analizar procede de una muestra de agua.

16. Dispositivo micro-electrónico sensor óptico basado en la técnica de la resonancia de plasmón superficial, que comprende bacterias (2) adheridas a la superficie de material conductor (1a) del sensor (1), perteneciendo dichas bacterias (2) a por lo menos una cepa huésped predeterminada, seleccionada para ser infectada por bacteriófagos específicos para dicha cepa.

17. Dispositivo según la reivindicación 16 donde el material conductor (1a) es oro.

18. Dispositivo según la reivindicación 16 donde las bacterias (2) son bacterias biotiniladas.

19. Dispositivo según la reivindicación 16 donde dichos bacteriófagos son colífagos somáticos o bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de Escherichia coli.

20. Dispositivo según la reivindicación 16 donde dichos bacteriófagos son bacteriófagos susceptibles de infectar cepas de bacterias lácticas.

21. Dispositivo según la reivindicación 16 en el que la solución de material a analizar procede de una muestra de material líquido o material solubilizado en un líquido.

22. Dispositivo según la reivindicación 16 en el que la solución de material a analizar procede de una muestra de agua.

23. Uso de un dispositivo micro-electrónico sensor óptico para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada según la reivindicación 16, mediante resonancia de plasmón superficial.