Procedimiento de fermentación para la producción de toxina diftérica.

Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de cultivar una cepa de Cor y nebacterium diphtheriae en medio en un fermentador en condiciones suficientes para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada,

de modo que la pO2 dentro del cultivo caiga a menos del 4% durante la mayoría de la etapa de fermentación y en el que se usa un agente antiespumante y/o una sonda de espuma o dispositivo mecánico rompedor de espuma en el fermentador.

Procedimiento de fermentación para la producción de toxina diftérica.

La presente invención se refiere al campo de los antígenos diftéricos, en particular toxinas (incluyendo formas mutantes de la toxina diftérica, como CRM197) y a procedimientos de fermentación para la fabricación de cultivos heterogéneos de dichos antígenos.

La toxina diftérica es una exotoxina de proteínas producida por la bacteria Cor y nebacterium diphtheriae. Se produce como un polipéptido único que se divide fácilmente para formar dos subunidades unidas por un puente disulfuro, Fragmento A y Fragmento B, como resultado de la escisión en el residuo 190, 192 ó 193 (Moskaug et al Biol. Chem.

264: 15709-15713, 1989) . El Fragmento A es la parte catalíticamente activa y es una ADP-ribosiltransferasa dependiente de NAD que se dirige específicamente a un factor de síntesis de proteínas EF-2, inactivando de este modo al EF-2 y deteniendo la síntesis de proteínas en una célula.

La inmunidad a una toxina bacteriana como la toxina diftérica puede adquirirse de forma natural durante el curso de una infección, o de forma artificial por inyección de una forma desintoxicada de la toxina (toxoide) (Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984) . Los toxoides se han preparado tradicionalmente mediante modificación química de toxinas nativas (Lingood et al Brit. J. Exp. Path. 44; 177, 1963) , haciéndolos no tóxicos, mientras que se conserva la antigenicidad que protege al animal vacunado contra la posterior exposición a la toxina natural. Como alternativa, se han descrito varias toxinas diftéricas mutadas que tienen toxicidad reducida (documentos US-4709017, US-4950740) .

CRM197 es una forma no tóxica de la toxina diftérica pero que es inmunológicamene indistinguible de la toxina diftérica. CRM197 es producida por C. diphtheriae infectada por la fase no toxinógena 1197tox-creada por mutagénesis con nitrosoguanidina del corinefago toxinógeno b (Uchida et al., Nature New Biology (1971) 233; 8-11) . La proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina diftérica pero difiere de ella en un único cambio de base en el gen estructural. Esto conduce a un cambio de glicina por glutamina del aminoácido en posición 52 que hace al fragmento A incapaz de unirse a NAD y, por lo tanto, no tóxico (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 págs. 560-564) .

El toxoide diftérico y una forma mutante con toxicidad reducida, CRM197, son componentes de muchas vacunas que proporcionan inmunidad contra Cor y nebacterium diphtheriae. Se conocen varias vacunas de combinación que pueden prevenir Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Cor y nebacterium diphtheriae y opcionalmente virus de Hepatitis B y/o Haemophilus influenzae de tipo b (véase, por ejemplo, los documentos WO-93/24148 y WO97/00697, W0-02/055105) .

También se han usado toxina diftérica y formas mutantes que incluyen CRM197 en vacunas como vehículos seguros y eficaces dependientes de células T para sacáridos. CRM197 se usa actualmente en la vacuna conjugada con CRM197 de oligosacárido de Haemophilus influenzae de tipo b (HibTitre ®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.) .

Los métodos para preparar toxoide diftérico (TD) se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el TD puede producirse mediante purificación de la toxina a partir de un cultivo de Cor y nebacterium diphtheriae seguido de desintoxicación química, o puede prepararse mediante purificación de un análogo recombinante, o desintoxicado genéticamente de la toxina (por ejemplo, CRM197, u otros mutantes como se describe en los documentos US-4.709.017, US5.843.711, US-5.601.827 y US-5.917.017) . Cor y nebacterium diphtheriae se cultiva en condiciones aerobias. Rappuoli et al (Biotechnology febrero de 1985, pág. 161-163) sugieren que la pO2 debe regularse al 25% mediante aireación con una mezcla de aire y oxígeno que se regula automáticamente para mantener la pO2 deseada.

La producción de cantidades significativas de toxinas diftéricas tales como CRM197 para su uso en vacunas se ha visto obstaculizada debido a la baja abundancia de proteínas. Este problema se ha abordado previamente mediante la introducción de copias adicionales de un gen que codifica la toxina diftérica o una forma mutante en Cor y nebacterium diphtheriae (documentos US-4.925.792; US-5.614.382) . Dichos métodos conducen a un aumento en la producción de aproximadamente tres veces. Los métodos para mejorar adicionalmente los rendimientos de toxina diftérica en una forma reproducible serían beneficiosos para permitir niveles más altos de producción de estos valiosos antígenos.

Por consiguiente, la presente solicitud proporciona un procedimiento de fermentación mejorado que comprende una etapa de fermentación de cultivar una cepa de Cor y nebacterium diphtheriae en medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo desciende a menos del 4% durante la mayoría de la etapa de fermentación.

La fermentación tiene lugar en condiciones aerobias, aunque de aireación limitada, de modo que se usa oxígeno hasta que entra en el cultivo durante la mayoría de la fermentación, es decir, después de la fase inicial en la que la densidad de C. diphtheriae es relativamente baja y los niveles de pO2 pueden ser más altos. Los inventores han descubierto que el cultivo en dichas condiciones da como resultado una expresión más eficaz y/o coherente de toxina diftérica o mutante en comparación con los métodos de fermentación realizados a una pO2 más alta. El procedimiento de la invención es más robusto que la fermentación a niveles más altos de oxígeno, y permite rendimientos de toxina diftérica que se mantienen altos incluso cuando el medio de cultivo contiene hierro añadido o cuando se usan materias primas complejas de calidad variable.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para fabricar una preparación de toxina diftérica o mutante de la misma que comprende realizar el procedimiento de fermentación de la invención y aislar la toxina diftérica o mutante de la misma a partir del cultivo. Aunque la toxina diftérica y los mutantes se describen en este documento, se prevé que puede aislarse cualquier antígeno de C. diphtheriae usando el procedimiento de la invención.

El uso de dicho método da como resultado rendimientos más elevados de toxina diftérica o mutante, por ejemplo CRM197, en comparación con cuando se mantiene la pO2 al 5% o superior, por ejemplo al 20%.

Descripción de las figuras Figura 1 -Gráficos que muestran el perfil de oxigenación y su uso para determinar el KLa de una fermentación. El panel A muestra la evolución temporal de la oxigenación después de un desplazamiento de nitrógeno a aire. El panel B muestra una representación de ln (100-pO2) con respecto al tiempo que permite la evaluación del KLa mediante la determinación del gradiente de la línea.

Figura 2 -Visión general de un procedimiento de fermentación para C. diphtheriae.

Figura 3 -Gráfico que muestra la cinética típica de crecimiento de un cultivo de C. diphtheriae. La línea con marcadores circulares muestra la DO a 650 nm después de diversos tiempos de cultivo. La línea marcada con rombos muestra el pH del cultivo.

Figura 4 -Geles SDS-PAGE de sobrenadantes de cultivo. Pista 1 -marcadores de peso molecular, pista 2-1 !g de CRM197 estándar, pista 3-0, 5 !g de CRM197 estándar, pista 4-0, 25 !g de CRM197 estándar, pistas 511, sobrenadantes de fermentaciones de C. diphtheriae. El Gel A muestra los sobrenadantes de CDT082 en la pista 5, CDT198 en las pistas 6-8 (el sobrenadante se retiró a las 22, 5 horas para la pista 6, 24 horas para la pista 7 y 28 horas para la pista 8) , CDT199 en las pistas 9, 10 y 11 (el sobrenadante se retiró a las 22 horas 45 minutos en la pista 9, 24 horas 45 minutos en la pista 10 y después de la posterior microfiltración y filtración en la pista 11) . El Gel B muestra sobrenadantes de CDT082 en la pista 5, de CDT205 en las pistas 6-9 (pista 7 después de 21 horas 43 min de fermentación, pista 8 después de 23 horas de fermentación, pista 9 después de 24 horas de fermentación) y de CDT206 en las pistas 10-13 (pista 10 después de 22 horas 10 minutos de fermentación, pista 11 después de 23 horas 49 minutos de fermentación, pista 12 después de 24 horas 30 minutos de fermentación, pista 13 después... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de cultivar una cepa de Cor y nebacterium diphtheriae en medio en un fermentador en condiciones suficientes para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada, de modo que la pO2 dentro del cultivo caiga a menos del 4% durante la mayoría de la etapa de fermentación y en el que se usa un agente antiespumante y/o una sonda de espuma o dispositivo mecánico rompedor de espuma en el fermentador.

2. El procedimiento de fermentación de la reivindicación 1, en el que la pO2 cae hasta aproximadamente cero durante la mayoría de la etapa de fermentación.

3. El procedimiento de fermentación de la reivindicación 1 ó 2, en el que la pO2 de menos del 4% se mantiene desde el momento en el que la Cor y nebacterium diphtheriae ha crecido a una densidad suficiente para que la pO2 caiga a menos del 4% debido al rápido consumo de oxígeno, hasta que la etapa de fermentación esté completa.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la etapa de fermentación se realiza a un KLa constante.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de fermentación se realiza a una velocidad de agitación y una tasa de aireación constantes.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la etapa de fermentación se realiza en condiciones de KLa variables.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de fermentación se realiza a un KLa de 10-50 h-1.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la etapa de fermentación tiene lugar en un fermentador de 10-30 litros y a un KLa de 10-30 h-1.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la etapa de fermentación tiene lugar en un fermentador d.

10. 250 litros a un KLa d.

3. 60 h-1.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la etapa de fermentación tiene lugar en un fermentador d.

25. 800 litros a un KLa d.

6. 150 h-1.

11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la etapa de fermentación tiene lugar con un flujo de aire comprimido de 1-5 Umin y una velocidad de agitación d.

20. 400 rpm.

12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la etapa de fermentación tiene lugar con un flujo de aire comprimido de 15-25 Umin y una velocidad de agitación d.

15. 250 rpm.

13. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el medio es CY, SOC o un medio similar y el pH dentro del fermentador se mantiene entre 7, 0 y 7, 8 mediante el grado de aireación sin que se requiera la adición de un ácido o una base.

14. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la cepa de Cor y nebacterium diphtheriae produce toxina diftérica o un mutante de la misma, en particular CRM197.

15. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que la cepa de Cor y nebacterium diphtheriae es ATCC29255.

16. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en el que el medio contiene entre 10 y 4000 ppb de hierro.

17. Un procedimiento para fabricar una preparación de un antígeno de C. diphtheriae que comprende las etapas de realizar el procedimiento de fermentación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y aislar el antígeno de C. diphtheriae a partir del cultivo.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el antígeno de C. diphtheriae es toxina diftérica o un fragmento o un mutante de la misma (por ejemplo CRM197) .

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 17-18, que comprende una etapa de añadir uno o más antígeno o antígenos adicionales al antígeno de C. diphtheriae.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, que comprende además una etapa de conjugar la toxina diftérica o un fragmento o un mutante de la misma con uno o más antígeno o antígenos adicionales