MICROORGANISMOS COMO PORTADORES DE SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN ANTIGENOS Y TOXINAS PROTEICAS, PROCEDIMIENTO DE PREPARACION Y SUS USOS.

Un microorganismo como portador de secuencias de nucleótidos para antígenos y toxinas proteicas que comprende los siguientes componentes:



(I) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada; y

(II) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica; y

(III)

a) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un sistema de transporte que permite la expresión de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o que codifica al menos una secuencia señal que permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o

b) opcionalmente, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína para lisar el microorganismo en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente plásmidos o vectores de expresión, que están contenidos en el microorganismo lisado; y

(IV) al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión de uno o más de los componentes (I) a (III), donde dicha secuencia de activación puede ser activada en el microorganismo y/o es específica de la célula tisular, específica de la célula tumoral, específica de macrófagos, específica de dendritas, específica de linfocitos, específica de la función o sin especificidad celular;

donde cualquiera de los componentes (I) a (IV) puede estar presente una vez o varias veces y si un componente de los componentes (I) a (IV) está presente varias veces puede ser independientemente idéntico o diferente; y

donde el componente (I) y el componente (II) no son idénticos, esto es el componente (I) no codifica al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/062237.

Solicitante: ETERNA ZENTARIS GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: WEISMULLERSTRASSE 50,60314 FRANKFURT AM MAIN.

Inventor/es: GOEBEL, WERNER, GENTSCHEV,IVAYLO, RAPP,ULF-R, FENSTERLE,JOACHIM.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 2 de Junio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • C12N15/62 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N15/62A

Clasificación PCT:

  • A61K39/385 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Haptenos o antígenos, unidos a soportes.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.

Fragmento de la descripción:

Microorganismos como portadores de secuencias de nucleótidos que codifican antígenos y toxinas proteicas, procedimiento de preparación y sus usos.

Campo técnico

La invención se refiere a microorganismos como portadores de secuencias de nucleótidos heterogéneas que codifican antígenos y toxinas proteicas, a un procedimiento para su fabricación así como a los correspondientes plásmidos o vectores de expresión. Estos microorganismos se pueden utilizar como medicamentos, en particular como vacunas para tumores para el tratamiento de diferentes tumores.

Técnica anterior

La inmunoterapia del cáncer representa una opción prometedora del tratamiento tumoral. Una multiplicidad de pruebas clínicas que utilizan diferentes enfoques se concentran en su eficacia en los pacientes. En principio, se establece una distinción entre la inmunoterapia pasiva y activa.

La inmunoterapia activa apunta a la inducción de una respuesta inmunitaria específica de un tumor relacionada con una vacuna. Esta última se está poniendo a prueba clínicamente en la actualidad utilizando varios enfoques diferentes. Por ejemplo existen las denominadas vacunas con células completas, cuya materia prima son células tumorales que o bien se obtienen directamente del paciente (autólogas) o derivadas de líneas celulares apropiadas (heterólogas). Estas células normalmente son desactivadas después, manipuladas diferencialmente y re(aplicadas) al paciente.

En contraste, las vacunas de antígeno específico contienen uno (o más) antígenos específicos de tumores, porciones del antígeno o el ADN que codifica el antígeno específico como también las vacunas denominadas anti-idiotipo. Normalmente estas vacunas no son aisladas, si no inyectadas combinadas con un portador apropiado. Por consiguiente, por una parte se utilizan diferentes adyuvantes clásicos, pero también combinaciones con inmunoestimuladores biológicos tales como las citoquinas.

Para la inmunoestimulación, se están aplicando enfoques, que contienen antígenos asociados con inmunoestimuladores, tales como la toxina del tétanos. Además, existen intentos de aplicar antígenos combinados con células dendríticas. Y finalmente existen varios intentos con vacunas vivas recombinantes con portadores virales o bacterianos.

Se han utilizado proteínas de fusión de toxinas bacterianas, tales como la toxina del tétanos, la toxina shiga, la toxina letal o la toxina del cólera, como coadyuvantes con un antígeno como vacunas especialmente contra infecciones durante bastante tiempo (Freytag y Clements, 1999). Adicionalmente, también se utilizan toxinas nativas, a menudo combinadas con una molécula específica de una célula diana, tal como una molécula de la superficie celular de células tumorales, con el fin de destruir células diana.

En esto, las proteínas de fusión con la toxina nativa, que generalmente comprenden una unidad enzimática y un dominio de unión a la proteína, desarrollan su efecto óptimo en su uso como coadyuvantes (Freytag y Clements, 1999). Por medio de estas vacunas se obtiene una respuesta inmunitaria satisfactoria incluso después de la inmunización mucosal y particularmente después de la oral. El problema de estas proteínas de fusión es que las toxinas nativas son muy tóxicas y por lo tanto no pueden ser establecidas en seres humanos (Holmgren et al., 2005).

Una línea completa de investigación esta por lo tanto ocupada con la destoxificación de toxinas que al mismo tiempo conservan el efecto coadyuvante. No obstante, puesto que en la mayoría de los casos el efecto coadyuvante coincide con la actividad enzimática, que es responsable del efecto tóxico (Lycke et al., 1992), la destoxificación no se puede realizar de una manera directa, ni siquiera cuando parece que sea posible para algunas toxinas que no pierdan su actividad enzimática, actividad coadyuvante (Hormozi et al., 1999; Lycke et al., 1992).

En el caso de la toxina del cólera (CT) se han llevado a cabo numerosos intentos de destoxificación (Agren et al., 1999; Byun et al., 2001; Eriksson et al., 2004; Kweon et al., 2002; Sanchez et al., 2002), para lo cual, no obstante, prevalece el uso de coadyuvantes mucosales (Freytag y Clements). Por lo tanto, por encima de todo, una inducción eficaz de una respuesta de anticuerpos (principalmente de IgA mucosal), que reciben una ayuda creciente de células T restringidas al MHC de clase II relacionado con toxinas, es el principal pre-requisito para un coadyuvante mucosal para una vacuna que consiste en un antígeno proteico y una toxina fusionada o aplicada simultáneamente (Freytag y Clements).

En cuanto a la toxina del cólera, especialmente su subunidad B (CtxB) se somete a ensayo como coadyuvante puesto que es responsable de la unión al receptor GM-1 y no muestra efectos tóxicos cuando se aísla (Holmgren et al.). Las proteínas que se fusionan con CtxB se caracterizan por una inducción primaria de las denominadas respuestas inmunitarias Th2. Estas son respuestas de las células T, que están caracterizadas principalmente por las citoquinas, tales como IL-4 o IL-6, y que principalmente ocasionan la inducción de los anticuerpos, pero que no inician en absoluto o a lo sumo inician restringidamente una respuesta inmunitaria celular, concretamente de las células T citotóxicas (CTL) (Holmgren et al.).

Además CtxB como coadyuvante mucosal induce una tolerancia generalizada al antígeno proteico. La tolerancia generalizada describe el agotamiento o inactivación de los linfocitos específicos del antígeno, en particular de las células T o las células B. Esta clase de enfoque no es aplicable por lo tanto a la inducción de una respuesta inmunitaria generalizada (Holmgren et al.).

Al contrario que la aplicación mucosal, la aplicación intraperitoneal o subcutánea de una proteína de fusión toxina-antígeno puede inducir respuestas generalizadas así como citotóxicas bajas. Por supuesto esto se ha utilizado para la vacunación de tumores en sistemas modelo (remitirse p. ej. a (Becerra et al., 2003)). Sin embargo semejante respuesta también es obtenida con el propio antígeno purificado y depende principalmente del coadyuvante utilizado. Aparte del hecho de que las respuestas de los CTL medidas en el modelo son bastante bajas, no existe evidencia de que la protección sea dependiente de estos efectos. Por otra parte, el antígeno no se aplicó oralmente, si no solamente por medio de una inyección directa (s.c., i.d., i.m., i.p.) del antígeno.

Las proteínas antigénicas fusionadas a una toxina destoxificada son generalmente ineficaces si se aplican en forma de una vacuna para un tumor. Las razones principales son, si se encuentran presentes, solamente la baja inducción de una respuesta inmunitaria generalizada o incluso, en el caso de CtxB, la inducción de tolerancia generalizada así como la inducción de anticuerpos restringidos mucosalmente y de las respuestas inmunitarias de tipo Th2.

McSorley et al., por ejemplo, demostraron que la inmunización nasal con una proteína de fusión CtxB (que para una vacuna contra un tumor representa el modo preferido de inducir una respuesta generalizada) preferiblemente tolera y por lo tanto inactiva las células Th1, mientras no influyen en las células Th2 (McSorley et al., 1998). Las respuestas Th2 están caracterizadas por las células T coadyuvantes que producen predominantemente IL-4 o IL-6. Estas citoquinas son particularmente responsables del inicio de la producción de anticuerpos por las células B, que proporcionan protección en el caso de la mayor parte de las vacunas convencionales. Por el contrario, las células T Th1 secretan principalmente IL-2 e IFN-gamma, citoquinas por lo tanto, que juegan un papel en la respuesta inmunitaria celular. Dependiendo del objetivo de la estrategia de inmunización es de crucial importancia que se inicie una respuesta inmunitaria Th2 dominada por anticuerpos (denominada predisposición Th2) o Th1 dominada por células (denominada predisposición Th1).

En contraste, la inducción generalizada de una respuesta inmunitaria celular dominada por Th1 con células T coadyuvantes productoras de IFN-gamma y la inducción de las células T citotóxicas (CTL) es indispensable para la inmunoterapia tumoral.

La técnica anterior muestra que las toxinas pueden funcionar como coadyuvantes. Especialmente la toxina del cólera (CT, por sus siglas en Inglés) muestra un fuerte efecto coadyuvante. Sin embargo, este efecto es significativamente atenuado tan pronto como...

 


Reivindicaciones:

1. Un microorganismo como portador de secuencias de nucleótidos para antígenos y toxinas proteicas que comprende los siguientes componentes:

(I) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada; y

(II) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica; y

(III)

a) al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un sistema de transporte que permite la expresión de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o que codifica al menos una secuencia señal que permite la secreción de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II); y/o

b) opcionalmente, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína para lisar el microorganismo en el citosol de las células de mamífero y para liberar intracelularmente plásmidos o vectores de expresión, que están contenidos en el microorganismo lisado; y

(IV) al menos una secuencia de nucleótidos para al menos una secuencia de activación para la expresión de uno o más de los componentes (I) a (III), donde dicha secuencia de activación puede ser activada en el microorganismo y/o es específica de la célula tisular, específica de la célula tumoral, específica de macrófagos, específica de dendritas, específica de linfocitos, específica de la función o sin especificidad celular;

donde cualquiera de los componentes (I) a (IV) puede estar presente una vez o varias veces y si un componente de los componentes (I) a (IV) está presente varias veces puede ser independientemente idéntico o diferente; y

donde el componente (I) y el componente (II) no son idénticos, esto es el componente (I) no codifica al menos una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una toxina proteica y/o al menos una subunidad de una toxina proteica.

2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en "bacterias, bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativas, células eucarióticas" y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en "Escherichia spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Yersinia spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio spp., Vibrio cholerae, Listeria spp., Listeria monocytogenes, Shigella spp., Shigella flexneri, Yersinia spp, Pseudomonas spp", donde preferiblemente la virulencia del microorganismo está atenuada.

3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 2, donde Vibrio cholerae se excluye como microorganismo.

4. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos: "receptores; porción extracelular, transmembrana o intracelular de un receptor; molécula de adherencia; porción extracelular, transmembrana o intracelular de una molécula de adherencia; proteína transductora de la señal; proteína del ciclo celular; factor de transcripción; proteína de diferenciación; proteína embrionaria; proteína viral; alergeno; proteína de patógeno microbiano; proteína de patógeno eucariótico; proteína antigénica de cáncer de testículo; proteína antigénica tumoral; y/o proteína específica de células tisulares",

donde la célula tisular se selecciona del grupo que consiste en "glándula tiroidea, glándula mamaria, glándula salivar, nódulo linfoide, glándula mamaria, mucosa de la túnica gástrica, riñón, ovario, próstata, cérvix, túnica serosa de la vesícula urinaria y lunares".

5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 4, donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos: "Her-2/neu, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos, receptor de midquinas, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta, receptor de lactoferrina, mielina básica, alfa-lactalbúmina, GFAP, proteína ácida fibrilar, tirosinasa, EGR-1, MUC1, c-Raf (Raf-1), A-Raf, B-Raf, B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf KD, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD, N-Ras, K-Ras, H-Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, A1, Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IAO2, XIAP, ML-IAP LIVIN, survivina, APAF-1, ciclina D(1-3), ciclina E, ciclina A, ciclina B, ciclina H, Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk-7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1-5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, Akt, P13K, mTOR, p53 y homólogos, C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Sp1, antígeno específico de próstata (PSA), antígeno carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, PAP; PSMA; STEAP; MAGE, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA, MART, Gp100, tirosinasa, GRP, TCF-4, antígenos virales de los virus HIV, HPV, HCV, HPV, VEB, CMV, VES, virus influenza, virus influenza de tipo A, virus influenza de tipo A (H5N1) y (H3N2), virus influenza de tipo B, virus influenza de tipo C; hemaglutininas, hemaglutinina H1, hemaglutinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), neuramidasa, p60, LLO, ureasa, CSP, calflagina y/o CPB" o donde el al menos un antígeno completo o parcial de al menos una proteína de tipo salvaje o mutada de acuerdo con el componente (I) se selecciona del grupo de quinasas que consisten en las siguientes proteínas de tipo salvaje y sus mutantes conocidos (números de acceso entre paréntesis): AAK1 (NM 014911), AATK (NM 004920), ABL1 (NM 005157), ABL2 (NM 005158), ACK1 (NM 005781), ACVR1 (NM 001105), ACVR1B (NM 020328), ACVR2 (NM 001616), ACVR2B (NM 001106), ACVRL1 (NM 000020), ADCK1 (NM 020421), ADCK2 (NM 052853), ADCK4 (NM 024876), ADCK5 (NM 174922), ADRBK1 (NM 001619), ADRBK2 (NM 005160), AKT1 (NM 005163), AKT2 (NM 001626), AKT3 (NM 005465), ALK (NM 004304), ALK7 (NM 145259), ALS2CR2 (NM 018571), ALS2CR7 (NM 139158), AMHR2 (NM 020547), ANKK1 (NM 178510), ANKRD3 (NM 020639), APEG1 (NM 005876), ARAF (NM 001654), ARK5 (NM 014840), ATM (NM 000051), ATR (NM 001184), AURKA (NM 003600), AURKB (NM 004217), AURKC (NM 003160), AXL (NM 001699), BCKDK (NM 005881), BCR (NM 004327), BIKE (NM 017593), BLK (NM 001715), BMPR1A (NM 004329), BMPR1B (NM 001203), BMPR2 (NM 001204), BMX (NM 001721), BRAF (NM 004333), BRD2 (NM 005104), BRD3 (NM 007371), BRD4 (NM 014299), BRDT (NM 001726), BRSK1 (NM 032430), BRSK2 (NM 003957), BTK (NM 000061), BUB1 (NM 004336), BUB1B (NM 001211), CABC1 (NM 020247), CAMK1 (NM 003656), CaMK1b (NM 198452), CAMK1D (NM 020397), CAMK1G (NM 020439), CAMK2A (NM 015981), CAMK2B (NM 001220), CAMK2D (NM 001221), CAMK2G (NM 001222), CAMK4 (NM 001744), CAMKK1 (NM 032294), CAMKK2 (NM 006549), CASK (NM 003688), CCRK (NM 012119), CDC2 (NM 001786), CDC2L1 (NM 001787), CDC2L5 (NM 003718), CDC42BPA (NM 014826), CDC42BPB (NM 006035), CDC7L1 (NM 003503), CDK10 (NM 003674), CDK11 (NM 015076), CDK2 (NM 001798), CDK3 (NM 001258), CDK4 (NM 000075), CDK5 (NM 004935), CDK6 (NM 001259), CDK7 (NM 001799), CDK8 (NM 001260), CDK9 (NM 001261), CDKL1 (NM 004196), CDKL2 (NM 003948), CDKL3 (NM 016508), CDKL4 (NM 001009565), CDKL5 (NM 003159), CHEK1 (NM 001274), CHUK (NM 001278), CIT (NM 007174), CLK1 (NM 004071), CLK2 (NM 003993), CLK3 (NM 003992), CLK4 (NM 020666), CRK7 (NM 016507), CSF1R (NM 005211), CSK (NM 004383), CSNK1A1 (NM 001892), CSNK1D (NM 001893), CSNK1E (NM 001894), CSNK1G1 (NM 022048), CSNK1G2 (NM 001319), CSNK1G3 (NM 004384), CSNK2A1 (NM 001895), CSNK2A2 (NM 001896), DAPK1 (NM 004938), DAPK2 (NM 014326), DAPK3 (NM 001348), DCAMKL1 (NM 004734), DCAMKL2 (NM 152619), DCAMKL3 (XM 047355), DDR1 (NM 013993), DDR2 (NM 006182), DMPK (NM 004409), DMPK2 (NM 017525.1), DYRK1A (NM 001396), DYRK1B (NM 006484), DYRK2 (NM 006482), DYRK3 (NM 003582), DYRK4 (NM 003845), EEF2K (NM 013302), EGFR (NM 005228), EIF2AK3 (NM 004836), EIF2AK4 (NM_001013703), EPHA1 (NM 005232), EPHA10 (NM 001004338), EPHA2 (NM 004431), EPHA3 (NM 005233), EPHA4 (NM 004438), EPHA5 (NM 004439), EPHA6 (XM 114973), EPHA7 (NM 004440), EPHA8 (NM 020526), EPHB1 (NM 004441), EPHB2 (NM 017449), EPHB3 (NM 004443), EPHB4 (NM 004444), EPHB6 (NM 004445), ERBB2 (NM 004448), ERBB3 (NM 001982), ERBB4 (NM 005235), ERK8 (NM 139021), ERN1 (NM 001433), ERN2 (NM 033266), FASTK (NM 025096), FER (NM 005246), FES (NM 002005), FGFR1 (NM 000604), FGFR2 (NM 022970), FGFR3 (NM 000142), FGFR4 (NM 022963), FGR (NM 005248), FLJ23074 (NM 025052), FLJ23119 (NM 024652), FLJ23356 (NM 032237), FLT1 (NM 002019), FLT3 (NM 004119), FLT4 (NM 002020), FRAP1 (NM 004958), FRK (NM 002031), FYN (NM 002037), GAK (NM 005255), GPRK5 (NM 005308), GPRK6 (NM 002082), GPRK7 (NM 139209), GRK4 (NM 005307), GSG2 (NM 031965), GSK3A (NM 019884), GSK3B (NM 002093), GUCY2C (NM 004963), GUCY2D (NM 000180), GUCY2F (NM 001522), H11 (NM 014365), HAK (NM 052947), HCK (NM 002110), HIPK1 (NM 152696), HIPK2 (NM 022740), HIPK3 (NM 005734), HIPK4 (NM 144685), HRI (NM 014413), HUNK (NM 014586), ICK (NM 016513), IGF1R (NM 000875), IKBKB (NM 001556), IKBKE (NM 014002), ILK (NM 004517), INSR (NM 000208), INSRR (NM 014215), IRAK1 (NM 001569), IRAK2 (NM 001570), IRAK3 (NM 007199), IRAK4 (NM 016123), ITK (NM 005546), JAK1 (NM 002227), JAK2 (NM 004972), JAK3 (NM 000215), KDR (NM 002253), KIS (NM 144624), KIT (NM 000222), KSR (XM 290793), KSR2 (NM 173598), LAK (NM 025144), LATS1 (NM 004690), LATS2 (NM 014572), LCK (NM 005356), LIMK1 (NM 016735), LIMK2 (NM 005569), LMR3 (XM 055866), LMTK2 (NM 014916), LOC149420 (NM 152835), LOC51086 (NM 015978), LRRK2 (XM 058513), LTK (NM 002344), LYN (NM 002350), MAK (NM 005906), MAP2K1 (NM 002755), MAP2K2 (NM 030662), MAP2K3 (NM 002756), MAP2K4 (NM 003010), MAP2K5 (NM 002757), MAP2K6 (NM 002758), MAP2K7 (NM 005043), MAP3K1 (XM 042066), MAP3K10 (NM 002446), MAP3K11 (NM 002419), MAP3K12 (NM 006301), MAP3K13 (NM 004721), MAP3K14 (NM 003954), MAP3K2 (NM 006609), MAP3K3 (NM 002401), MAP3K4 (NM 005922), MAP3K5 (NM 005923), MAP3K6 (NM 004672), MAP3K7 (NM 003188), MAP3K8 (NM 005204), MAP3K9 (NM 033141), MAP4K1 (NM 007181), MAP4K2 (NM 004579), MAP4K3 (NM 003618), MAP4K4 (NM 145686), MAP4K5 (NM 006575), MAPK1 (NM 002745), MAPK10 (NM 002753), MAPK11 (NM 002751), MAPK12 (NM 002969), MAPK13 (NM 002754), MAPK14 (NM 001315), MAPK3 (NM 002746), MAPK4 (NM 002747), MAPK6 (NM 002748), MAPK7 (NM 002749), MAPK8 (NM 002750), MAPK9 (NM 002752), MAPKAPK2 (NM 032960), MAPKAPK3 (NM 004635), MAPKAPK5 (NM 003668), MARK (NM 018650), MARK2 (NM 017490), MARK3 (NM 002376), MARK4 (NM 031417), MAST1 (NM 014975), MAST205 (NM 015112), MAST3 (XM 038150), MAST4 (XM 291141), MASTL (NM 032844), MATK (NM 139355), MELK (NM 014791), MERTK (NM 006343), MET (NM 000245), MGC33182 (NM 145203), MGC42105 (NM 153361), MGC43306 (C9orf96), MGC8407 (NM 024046), MIDORI (NM 020778), MINK (NM 015716), MKNK1 (NM 003684), MKNK2 (NM 017572), MLCK (NM 182493), MLK4 (NM 032435), MLKL (NM 152649), MOS (NM 005372), MST1R (NM 002447), MST4 (NM 016542), MUSK (NM 005592), MYLK (NM 053025), MYLK2 (NM 033118), MYO3A (NM 017433), MYO3B (NM 138995), NEK1 (NM 012224), NEK10 (NM 152534), NEK11 (NM 024800), NEK2 (NM 002497), NEK3 (NM 002498), NEK4 (NM 003157), NEK5 (MGC75495), NEK6 (NM 014397), NEK7 (NM 133494), NEK8 (NM 178170), NEK9 (NM 033116), NLK (NM 016231), NPR1 (NM 000906), NPR2 (NM 003995), NRBP (NM 013392), NRBP2 (NM 178564), NRK (NM 198465), NTRK1 (NM 002529), NTRK2 (NM 006180), NTRK3 (NM 002530), OBSCN (NM 052843), OSR1 (NM 005109), PACE-1 (NM 020423), PAK1 (NM 002576), PAK2 (NM 002577), PAK3 (NM 002578), PAK4 (NM 005884), PAK6 (NM 020168), PAK7 (NM 020341), PASK (NM 015148), PCTK1 (NM 006201), PCTK2 (NM 002595), PCTK3 (NM 212503), PDGFRA (NM 006206), PDGFRB (NM 002609), PDK1 (NM 002610), PDK2 (NM 002611), PDK3 (NM 005391), PDK4 (NM 002612), PDPK1 (NM 002613), PFTK1 (NM 012395), PHKG1 (NM 006213), PHKG2 (NM 000294), PIK3R4 (NM 014602), PIM1 (NM 002648), PIM2 (NM 006875), PIM3 (NM 001001852), PINK1 (NM 032409), PKE (NM 173575), PKMYT1 (NM 004203), pknbeta (NM 013355), PLK (NM 005030), PLK3 (NM 004073), PRKAA1 (NM 006251), PRKAA2 (NM 006252), PRKACA (NM 002730), PRKACB (NM 002731), PRKACG (NM 002732), PRKCA (NM 002737), PRKCB1 (NM 002738), PRKCD (NM 006254), PRKCE (NM 005400), PRKCG (NM 002739), PRKCH (NM 006255), PRKCI (NM 002740), PRKCL1 (NM 002741), PRKCL2 (NM 006256), PRKCM (NM 002742), PRKCN (NM 005813), PRKCQ (NM 006257), PRKCZ (NM 002744), PRKD2 (NM 016457), PRKDC (NM 006904), PRKG1 (NM 006258), PRKG2 (NM 006259), PRKR (NM 002759), PRKWNK1 (NM 018979), PRKWNK2 (NM 006648), PRKWNK3 (NM 020922), PRKWNK4 (NM 032387), PRKX (NM 005044), PRKY (NM 002760), PRPF4B (NM 003913), PSKH1 (NM 006742), PSKH2 (NM 033126), PTK2 (NM 005607), PTK2B (NM 004103), PTK6 (NM 005975), PTK7 (NM 002821), PTK9 (NM 002822), PTK9L (NM 007284), PXK (NM 017771), QSK (NM 025164), RAD53 (NM 007194), RAF1 (NM 002880), RAGE (NM 014226), RET (NM 020975), RHOK (NM 002929), RIOK1 (NM 031480), RIOK2 (NM 018343), RIPK1 (NM 003804), RIPK2 (NM 003821), RIPK3 (NM 006871), RIPK5 (NM 015375), RNASEL (NM 021133), ROCK1 (NM 005406), ROCK2 (NM 004850), ROR1 (NM 005012), ROR2 (NM 004560), ROS1 (NM 002944), RPS6KA1 (NM 002953), RPS6KA2 (NM 021135), RPS6KA3 (NM 004586), RPS6KA4 (NM 003942), RPS6KA5 (NM 004755), RPS6KA6 (NM 014496), RPS6KB1 (NM 003161), RPS6KB2 (NM 003952), RPS6KC1 (NM 012424), RPS6KL1 (NM 031464), RYK (NM 002958), SBK (XM 370948), SCYL1 (NM 020680), SCYL2 (NM 017988), SGK (NM 005627), SgK069 (SU SgK069), SgK085 (XM 373109), SgK110 (SU SgK110), SGK2 (NM 016276), SgK223 (XM 291277), SgK269 (XM 370878), SgK424 (CGP SgK424), SgK493 (SU_SgK493), SgK494 (NM 144610), SgK495 (NM 032017), SGKL (NM 013257), SK681 (NM 001001671), SLK (NM 014720), SMG1 (NM 015092), SNARK (NM 030952), SNF1 LK (NM 173354), SNF1 LK2 (NM 015191), SNK (NM 006622), SNRK (NM 017719), SRC (NM 005417), SRMS (NM 080823), SRPK1 (NM 003137), SRPK2 (NM 003138), SSTK (NM 032037), STK10 (NM 005990), STK11 (NM 000455), STK16 (NM 003691), STK17A (NM 004760), STK17B (NM 004226), STK18 (NM 014264), STK19 (NM 032454), STK22B (NM 053006), STK22C (NM 052841), STK22D (NM 032028), STK23 (NM 014370), STK24 (NM 003576), STK25 (NM 006374), STK3 (NM 006281), STK31 (NM 031414), STK32B (NM 018401), STK33 (NM 030906), STK35 (NM 080836), STK36 (NM 015690), STK38 (NM 007271), STK38L (NM 015000), STK39 (NM 013233), STK4 (NM 006282), STLK5 (NM 001003787), STYK1 (NM 018423), SUDD (NM 003831), SYK (NM 003177), TAF1 (NM 138923), TAF1L (NM 153809), TAO1 (NM 004783), TAOK1 (NM 020791), TAOK3 (NM 016281), TBCK (NM 033115), TBK1 (NM 013254), TEC (NM 003215), TEK (NM 000459), TESK1 (NM 006285), TESK2 (NM 007170), TEX14 (NM 031272), TGFBR1 (NM 004612), TGFBR2 (NM 003242), TIE (NM 005424), TIF1 (NM 003852), TLK1 (NM 012290), TLK2 (NM 006852), TNIK (NM 015028), TNK1 (NM 003985), TOPK (NM 018492), TP53RK (NM 033550), TRAD (NM 007064), TRIB1 (NM 025195), TRIB2 (NM 021643), TRIB3 (NM 021158), TRIM28 (NM 005762), TRIM33 (NM 015906), TRIO (NM 007118), TRPM6 (NM 017662), TRPM7 (NM 017672), TRRAP (NM 003496), TSSK4 (NM 174944), TTBK1 (NM 032538), TTBK2 (NM 173500), TTK (NM 003318), TTN (NM 003319), TXK (NM 003328), TYK2 (NM 003331), TYRO3 (NM 006293), ULK1 (NM 003565), ULK2 (NM 014683), ULK3 (NM 015518), ULK4 (NM 017886), VRK1 (NM 003384), VRK2 (NM 006296), VRK3 (NM 016440), WEE1 (NM 003390), Wee1B (NM 173677), YANK1 (NM 145001), YES1 (NM 005433), ZAK (NM 016653), y/o ZAP70 (NM 001079).

6. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en "toxina bacteriana, enterotoxina, exotoxina, toxina de tipo I, toxina de tipo II, toxina de tipo III, toxina de tipo IV, toxina de tipo V, toxina RTX, toxina AB, toxina A-B, toxina A/B, toxina A+B, toxina A-5B y/o toxina AB5 ".

7. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 6, donde el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en "toxina de Adenilato ciclasa, toxina de Ántrax, toxina de Ántrax (EF), toxina de Ántrax (LF), toxina Botulinum, toxina de Cólera (CT, Ctx), subunidad B de toxina de Cólera (CTB, CtxB), toxina de Difteria (DT, Dtx), toxina LT de E. coli, enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT), subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), toxina ST de E. coli, enterotoxina estable al calor de E. coli (ST), toxina Eritrogénica, toxina Exfoliatina, Exotoxina A, enterotoxina de Perfringens, toxina de Pertussis (PT, Ptx), toxina Shiga (ST, Stx), subunidad B de toxina Shiga (STB, StxB), toxina de tipo Shiga, enterotoxinas de Staphylococcus, toxina del Tétanos (TT), toxina del Síndrome de choque tóxico (TSST-1), toxina Vero (VT), Toxina A (TA) y Toxina B (TB) de Clostridium difficile, Toxina Letal (LT) y Toxina Hemorrágica (HT) de Clostridium sordellii, Toxina alfa (AT) de Clostridium novyi".

8. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el componente (I) y el componente (II) se conectan entre sí para permitir la expresión y/o secreción de una proteína de fusión codificada por ambos componentes.

9. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 8, donde la proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en "CtxB-PSA, CtxB-B-Raf V600E KD, dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E, dominio quinasa CtxB-B-Raf V600E KD, CtxB-B-Raf, CtxB-B-Raf KD, dominio quinasa CtxB B-Raf KD, CtxB-HA1, CtxB-HA12C".

10. El microorganismo de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 1 a 9, donde el componente (III) a) se selecciona del grupo que consiste en "sistema de secreción de tipo I, sistema de secreción de tipo II, sistema de secreción de tipo III, sistema de secreción de tipo IV, sistema de secreción de tipo V, sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de del promotor específico de hly), sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico hly), señal de transporte para la proteína de la capa S (Rsa A) de Caulobacter crescentus, señal de transporte para la proteína ToIC de Escherichia coli, señal de secreción Vtgss y/o señales de secreción derivadas de de listeriolisina, p60 y/o ActA"

y

donde el componente (III) b) se selecciona del grupo que consiste en "endolisinas, proteína lítica de bacterias gram-positivas, proteína lítica de Listeria monocytogenes, PLY551 de Listeria monocytogenes y/o holina de Listeria monocytogenes".

11. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 10, donde el componente (III) a) es al menos una secuencia de nucleótidos que codifica solamente un sistema de transporte, que permite la expresión concomitante de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) sobre la superficie externa del microorganismo y/o permite la secreción concomitante de los productos de expresión del componente (I) y el componente (II), donde semejante componente (III) a) es preferiblemente al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly) o el sistema de transporte de hemolisina (señal) de Escherichia coli (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control de un promotor bacteriano no específico de hly).

12. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde de acuerdo con el componente (III) a) los productos de expresión del componente (I) y el componente (II) son secretados.

13. El microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde

el componente (I) se selecciona del grupo que consiste en B-Raf V600E, dominio quinasa B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, dominio quinasa B-Raf V600E KD, B-Raf KD, dominio quinasa B-Raf, dominio quinasa B-Raf KD, antígeno específico de próstata (PSA), hemaglutinina HA1 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferiblemente de virus Influenza A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1);

el componente (II) se selecciona del grupo que consiste en la "subunidad B de toxina del Cólera (CTB, CtxB), subunidad B de enterotoxina lábil al calor de E. coli (LTB), toxina del tétanos (TT)";

el componente (III) a) se selecciona del grupo que consiste en la "señal de transporte de hemolisina HlyA de Escherichia coli junto con componentes del sistema de secreción de Hly (secuencias de nucleótidos que contienen HlyA, HlyB y HlyD bajo el control del promotor específico de hly)";

el componente (IV) se selecciona del grupo que consiste en "el promotor endógeno del locus hly de E. coli";

donde el componente (I) y el componente (II) se conectan entre sí para permitir la expresión de una proteína de fusión codificada por ambos componentes y donde la proteína de fusión es secretada.

14. Una composición farmacéutica que comprende al menos un microorganismo, preferiblemente al menos un microorganismo liofilizado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cápsulas.

15. Un medicamento que comprende al menos un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o al menos una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14.

16. El uso de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de estados fisiológicos y/o patofisiológicos seleccionados del grupo que consiste en "división celular incontrolada, tumores malignos, tumores benignos, tumores sólidos, sarcomas, carcinomas, trastornos hiperproliferativos, carcinoides, sarcomas de Ewing, sarcomas de Kaposi, tumores cerebrales, tumores que se originan en el cerebro y/o el sistema nervioso y/o las meninges, gliomas, neuroblastomas, cáncer de estómago, cáncer de riñón, carcinomas de células renales, cáncer de próstata, carcinomas de próstata, tumores de tejido conectivo, sarcomas de tejidos blandos, tumores de páncreas, tumores de hígado, tumores de cabeza, tumores de cuello, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, osteosarcomas, retinoblastomas, timoma, cáncer testicular, cáncer de pulmón, carcinomas bronquiales, cáncer de mama, carcinomas de mama, cáncer intestinal, tumores colorrectales, carcinomas de colon, carcinomas de recto, tumores ginecológicos, tumores de ovario/tumores ováricos, cáncer uterino, cáncer cervical, carcinomas de cérvix, cáncer del cuerpo del útero, carcinomas del corpus, carcinomas endometriales, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, cáncer de piel, basaliomas, espinaliomas, melanomas, melanomas intraoculares, leucemia, leucemia crónica, leucemia aguda, linfomas, infección, infección viral o bacteriana, influenza, inflamación crónica, rechazo de órganos y/o enfermedades autoinmunitarias".

17. Un plásmido o vector de expresión que comprende los componentes (I) a (IV) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

18. Un procedimiento para la producción de un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde se produce un plásmido o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 17, y se transforma un microorganismo con este plásmido o vector de expresión.

19. Un kit farmacéutico que comprende al menos un microorganismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 o un medicamento de acuerdo con la reivindicación 15 y un tampón farmacológicamente aceptable, preferiblemente un tampón carbonato.


 

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