Método para la preparación de L-metionina mediante fermentación de bacterias corineformes recombinantes en el que se atenúa o atenúan uno o una pluralidad de los genes yaeC,

abc y yaeE, que codifican el sistema de absorción de metionina MetD2, en el que el gen yaeC codifica la proteína de unión periplasmática YaeC; el gen abc codifica una proteína de unión a ATP ABC, y el gen yaeE codifica una permeasa YaeE

Método para la preparación por fermentación de metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes.

El objeto de la invención es un método para la preparación por fermentación de L-metionina, mediante uso de bacterias corineformes recombinantes, que captan poca o ninguna metionina del medio circundante. Según la invención, esto se logra mediante atenuación, especialmente desactivación, del sistema de captación de metionina Met2, codificado a través de los genes yaeC, abc y yaeE.

Estado de la técnica

Los compuestos químicos, por medio de lo cual se quiere decir en particular L-aminoácidos, vitaminas, nucleósidos y nucleótidos y D-aminoácidos, encuentran uso en medicina humana, en la industria farmacéutica, en cosméticos, en la industria alimentaria y en alimentación animal.

Muchos de estos compuestos se preparan mediante fermentación de microorganismos, preferiblemente a partir de cepas de bacterias corineformes, preparados especialmente a partir del corynebacterium glutamicum.

Debido a la gran importancia, se ha llevado a cabo un trabajo a través de la mejora de métodos de fabricación. Las mejoras del proceso pueden implicar características técnicas de la fermentación como, por ejemplo, agitación y suministro de oxigeno o la composición del medio de cultivo tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación o el procesamiento de la producción, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico o las características de producción intrínseca del propio microorganismo.

Para la mejora de las características de comportamiento de estos microorganismos, se utilizan los métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera, las cepas que son resistentes a antimetabolitos, como por ejemplo el análogo de lisina S-(2-aminoetil)-cisteina o los análogos de metionina a-metil-metionina, etionina, norleucina, N-acetilnorleucina, S-trifluorometilhomocisteina, ácido 2-amino-5-heptenoico, seleno-metionina, metioninsulfoxamina, metoxina, ácido 1-aminociclopentanocarboxilico, son auxotróficos para metabolitos significativos reguladores y producen L-aminoácidos.

Durante varios años se ha empleado la tecnología de ADN recombinante para la mejora de cepas de cepas productoras de aminoácidos de corynebacterium glutamicum, en la que se amplifican genes de la biosintesis de aminoácidos particulares y se investiga el efecto sobre la producción del L-aminoácido.

Objeto de la invención

Se ha marcado como objetivo proporcionar nuevas bases para métodos mejorados para la preparación mediante fermentación de L-metionina, con bacterias corineformes.

Descripción de la invención

Más abajo se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos, queriendo decir con ello uno o una pluralidad de los aminoácidos proteinogénicos, incluyendo sus sales, seleccionados del grupo de ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutámico, L-glutamina, L-glicina, L-alanina, L-cisteina, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-arginina, y L-prolina. Se prefiere particularmente L-metionina.

Por aminoácidos proteinogénicos se entiende los aminoácidos que aparecen en proteínas naturales, esto es, en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. Sirven como entidades estructurales para las proteínas en las que están enlazados entre si mediante enlaces peptídicos.

La L-metionina o metionina mencionada más abajo se refiere también a las sales como, por ejemplo, hidrocloruro de metionina o sulfato de metionina.

La captación de metionina desde el medio de fermentación es muy importante para la producción de metionina, puesto que una posible reabsorción del producto excretado reducirla la tasa de producción. Los genes atenuados yaeE, abc y yaeC descritos en esta invención para corynebacterium glutamicum codifican la proteína ABC de unión a ATP y la permeasa YaeE, que juntos forman el sistema de captación de metionina MetD2, para la proteína de unión periplasmática YaeC.

La atenuación, y particularmente la desactivación, de uno o una pluralidad de los genes codificantes yaeC, abc y yaeE para el sistema de captación de metionina MetD2 mejora la producción de L-metionina en las bacterias corineformes correspondientes, en comparación con los organismos de partida sin atenuación o desactivación de estos genes.

El objeto de la invención es un método para la preparación mediante fermentación de L-metionina mediante uso de bacterias corineformes recombinantes, que en particular ya producen L-aminoácidos que captan menos metionina que los organismos de partida, o nada de metionina, del medio circundante, y en las cuales una o una pluralidad de la secuencia o secuencias nucleotidicas que codifican yaeC, abc y yaeC del sistema de captación de metionina MetD2 están atenuadas o en particular desactivadas o expresadas a un nivel más bajo.

Un objeto adicional de la invención es un método para la preparación mediante fermentación de L-metionina, en el que se llevan a cabo las siguientes etapas:

(a) fermentar la L-metionina produciendo bacterias corineformes recombinantes en un medio, en el que se capta menos metionina que los organismos de partida o no se capta metionina del medio circundante, y en el que al menos se atenúan, y especialmente se desactivan o se expresan en un nivel más bajo, al menos uno de los genes que codifican yaeE, abc y yaeC para el sistema de captación de metionina MetD2,

(b) enriquecer la L-metionina en el medio o en las células de la bacteria,

(c) aislar la L-metionina deseada, en la que, opcionalmente, los componentes del caldo de fermentación y/o la biomasa permanecen en porciones (> 0 a 100%) o en sus cantidades totales en el producto final.

Las bacterias corineformes producen L-metionina, preferiblemente ya antes de atenuar o desactivar la captación de metionina del medio circundante, lo que se logra por ejemplo atenuando o desactivando uno o una pluralidad de los genes yaeE, abc y yaeC.

Se encontró que los microorganismos, preferiblemente bacterias corineformes, que captan poca o ninguna metionina del medio circundante, lo que se logra atenuando o desactivando uno o una pluralidad de los genes que codifican yaeE, abc y yaeC para el sistema de captación de metionina MetD2, potencian la producción de L-aminoácidos, especialmente L-metionina.

Las secuencias nucleotidicas de los genes de corynebacterium glutamicum mencionados son conocidas para la técnica anterior más reciente, y se pueden citar diferentes Solicitudes de patentes junto con el banco de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA).

Genes yaeC:

Genes abc:

Genes yaeE:

Las secuencias que codifican los genes yaeC, abc y yaeE descritos en las localizaciones del texto dadas se pueden...

1. Método para la preparación de L-metionina mediante fermentación de bacterias corineformes recombinantes en el que se atenúa o atenúan uno o una pluralidad de los genes yaeC, abc y yaeE, que codifican el sistema de absorción de metionina MetD2, en el que el gen yaeC codifica la proteína de unión periplasmática YaeC; el gen abc codifica una proteína de unión a ATP ABC, y el gen yaeE codifica una permeasa YaeE.

2. El procedimiento para la preparación mediante fermentación de L-metionina según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

a) enriquecer L-metionina en el medio o en las células bacterianas, y

b) aislar dicho L-aminoácido, en el que opcionalmente los componentes del caldo de la fermentación y/o la biomasa permanecen en su totalidad o porciones en el producto final.

3. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se reduce la expresión del polinucleótido o polinucleótidos que codifica o codifican componentes de la captación de metionina desde el medio circundante, seleccionados de los genes yaeC, abc y yaeE, que codifican el sistema de captación de metionina.

4. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se disminuye la regulación y/o propiedades catalíticas de los polipéptidos (proteínas enzimáticas), para los cuales codifican los polinucleótidos yaeC, abc y yaeE.

5. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque para la preparación de L-metionina se hacen fermentar bacterias corineformes en las que al mismo tiempo se fortalece, especialmente se sobreexpresa, uno o una pluralidad de los genes seleccionados del grupo enumerado en la Tabla 1:

(Tabla pasa a página siguiente)

6. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque para la preparación de L-metionina se fermentan microorganismos corineformes en los que al mismo tiempo se atenúa uno o una pluralidad de genes, seleccionados del grupo enumerado en la Tabla 2:

7. El método según una o una pluralidad de reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se emplean microorganismos del tipo corynebacterium glutamicum.

8. Bacteria corineforme recombinante, en la que uno o una pluralidad de los genes, seleccionados del grupo de yaeC, abc y yaeE, que codifican la captación de metionina desde el medio circundante, codifican el sistema de captación de metionina MetD2, se atenúa o atenúan, en comparación con el organismo de partida sin el sistema de captación de metionina MetD2 atenuado, en la que el gen yaeC codifica una proteína de unión periplasmática YaeC; el gen abC codifica una proteína de unión a ATP ABC, y el gen yaeE codifica una permeasa YaeE.