Método de identificación de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella.

La presente invención, referida a un método de detección e identificación de las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella. Junto con este método, la invención también proporciona los cebadores y sondas necesarios para llevarlo a cabo

Método de identificación de especies bacterianas de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella.

La presente invención, se refiere a un método de detección e identificación de las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella. Junto con este método, la invención también proporciona los cebadores y sondas necesarios para llevarlo a cabo.

Estado de la técnica anterior

Actualmente, hay descritas unas 200 enfermedades zoonóticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme...) que el hombre puede padecer y que en países en vías de desarrollo constituyen una importante causa de mortandad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades.

Del mismo modo, en los países desarrollados determinadas zoonosis, que se extienden en aquéllos que se encuentran en vías de desarrollo, tienden a difundirse como consecuencia del aumento tráfico internacional de animales y viajeros, la concentración de la población en zonas urbanas y periurbanas, etc. Estas circunstancias, entre otras, conllevan un creciente riesgo de introducción de enfermedades exóticas en nuestro entorno.

Además, el hecho frecuente del hallazgo de artrópodos infectados por más de un patógeno, ocasiona que más de una zoonosis pueda ser transmitida a través de una única picadura. En este sentido, cada vez son más comunes las hospitalizaciones de individuos que presentan cuadros clínicos producidos por el contacto con animales o artrópodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, ácaros, etc., los cuales actúan como vectores o como reservorios de patógenos. Dichos cuadros clínicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificación rápida y fiable del agente causante de la patología, no siendo posible la aplicación rápida de tratamientos específicos, que ocasiones llegan demasiado tarde. Esta circunstancia justifica la necesidad de un método integrado de detección e identificación de especies bacterianas causantes de zoonosis.

Hasta el momento, los métodos moleculares de diagnósticos disponibles se limitan básicamente a la detección de los patógenos mediante tecnología de anticuerpo. Este tipo de análisis, generalmente retrospectivo y en ocasiones de baja sensibilidad, suelen ser de escasa ayuda en para tratamiento de enfermedades en fase aguda.

Otra de las alternativas para la detección e identificación de patógenos está basada en la aplicación de medios cultivo. Este tipo de técnicas son de escasa aplicabilidad para determinadas especies de géneros como Bartonella y Anaplasma/Ehrlichia, debido a que éstas no crecen generalmente en los medios de cultivo habituales e incluso pueden llegar a necesitar cultivos celulares. Por estas circunstancias ocasionan que estas metodologías estén apartadas de las prácticas habituales en los laboratorios de microbiología de los hospitales. Una de las alternativas más eficaces a este tipo de metodologías la constituye el análisis directo de material genético, fundamentado en la tecnología PCR. Esta tecnología, aunque muy efectiva, encuentra su mayor limitación en la dificultad para encontrar marcadores o regiones especificas, así como cebadores y sondas, que permitan un análisis fiable de las muestras.

Recientemente, se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. et al. 2005. FEMS Microbiology Letters 243:273-8), que describe un método basado en el análisis de ADN ribosomal, aunque emplea cebadores universales, que amplifican material genético tanto de bacterias diana como de otras que no los son, lo que ocasiona que su sensibilidad sea bastante reducida.

Otros métodos como los descritos por las patentes americanas US 6,300,072 y 6,518,020 son capaces de detectar e identificar bacterias del género Bartonella, mediante el empleo de la misma región 16S-23S, aunque sin embargo el número de especies dentro de este género ha aumentado sensiblemente desde el depósito de dichas patentes y su aproximación, que consiste en una discriminación entre especies según el tamaño del amplicón obtenido en una PCR, no es útil para determinadas especies del género actualmente conocidas que comparten un tamaño de fragmento amplificado similar.

Breve descripción de la invención

La presente invención propone el empleo de los genes 16S y msp2 y el espacio intergénico 16S-23S para la detección e identificación de diferentes especies y grupos de especies bacterianas zoonóticas, aportando mejoras respecto de los procedimientos descritos anteriormente, puesto que éste es capaz de detectar específicamente un número muy elevado especies bacterianas, mediante el empleo de sondas y cebadores con unos niveles de sensibilidad bastante elevados.

Así, la presente invención consigue resolver el problema de lo tedioso y complicado que resulta detectar un elevado número de especies bacterianas zoonóticas, que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit de detección basado en la tecnología PCR. Concretamente, la invención permite analizar diferentes regiones del ADN bacteriano de los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella para llevar a cabo identificaciones de género y especie, según se muestra en la siguiente tabla (Tabla 1).

En la mayoría de los casos, las especies identificadas se corresponden a especies cultivadas y en otros se refieren a especies aisladas por primera vez (especies no cultivadas). Dichas especies han sido obtenidas a partir de muestras de las especies Meles meles (tejón), Ixodes ricinus y Apodemus sylvaticus y han sido caracterizadas por las secuencias AJ269792, SEQ ID NO:44-46, según se muestra en la tabla 3.

Breve descripción de las figuras

Figura 1.- Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Bartonella. En la membrana de la izquierda se observa la ausencia de reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Bartonella. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA.

Figura 2.- Esta figura muestra dos membranas de hibridación para la validación de los cebadores y sondas empleados en las detecciones del género Anaplasma/Ehrlichia. En la membrana de la izquierda se observa la ausencia de reactividad cruzada entre las diferentes sondas dentro del género. En la membrana de la derecha puede observarse como no existe reactividad cruzada de las sondas con muestras ajenas al propio género Anaplasma/Ehrlichia. La sonda S-CI2 hace referencia a la sonda empleada como CIA.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, ésta se refiere a un método (en adelante, método de la invención) para la detección e identificación, preferentemente de manera simultanea, de cualquiera de las especies y géneros bacterianos, según se indica en las tablas 2 y 3, que comprende los siguientes pasos:

Los cebadores para llevar a cabo el método de la invención pueden ser diseñados por alineamiento múltiple de las secuencias que comprenden las SEQ ID NO:1-17 y 47 con programas informáticos como CLUSTAL X, permiten la identificación de regiones muy conservadas que servirán molde para el diseño de los cebadores, que deben ser validados posteriormente empíricamente.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores son capaces de hibridar con diferentes regiones nucleotídicas de los genes 16S, mp2 y espacio intergénico 16S-23S (tablas 2 y 3), aunque preferentemente dichos cebadores tienen las secuencias seleccionadas...

1. Método para la detección simultánea de especies bacterianas causantes de zoonosis, pertenecientes a los géneros Anaplasma/Ehrlichia y Bartonella, que comprende los siguientes pasos:

2. Método para la detección simultánea de especies bacterianas según reivindicación 1, donde los cebadores consisten en las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:18-25 y sus secuencias complementarias.

3. Método para la detección simultánea de especies bacterianas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la detección de los productos de amplificación se realiza mediante sondas que consisten en las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:26-42 y 48 y sus secuencias complementarias.

4. Cebadores cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:20-21 y sus secuencias complementarias, donde dichos cebadores permiten la amplificación de cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO: 2-7 y 47.

5. Cebadores cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:22-23 y sus secuencias complementarias, donde dichos cebadores permiten la amplificación de la secuencia que comprende la SEQ ID NO: 8.

6. Sondas cuya secuencia consiste en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:26-42 y 48 y sus secuencias complementarias, donde dichas sondas son capaces de hibridar con las secuencias seleccionadas del grupo que comprende SEQ ID NO:1-17 y 47 y su secuencias complementarias, según se indica en las tablas 2 y 3.

7. Kit de análisis capaz de llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Kit según la reivindicación anterior que comprende cebadores según las reivindicaciones 4 y 5.

9. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 que comprende sondas según la reivindicaciones 6.