Líneas celulares madre derivadas de embriones de pato para la producción de vacunas virales.

Un procedimiento para obtener líneas celulares aviares diploides continuas,

derivadas de células madresembrionarias (ES) aviares, en el que dichas líneas celulares aviares son capaces de proliferar en un medio basal enausencia de factores de crecimiento y capa alimentadora y no producen partículas de retrovirus endógenoscompetentes para la replicación, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) aislar embrión o embriones de pájaros en una fase del desarrollo en torno a la oviposición, en dondedichos pájaros se seleccionan del orden de los Anseriformes y el genoma de dichos pájaros no contienesecuencias provirales endógenas susceptibles de producir partículas retrovirales endógenas competentespara la replicación;

b) suspender células madres embrionarias (ES) aviares, obtenidas disociando embrión o embriones de laetapa a) en un medio de cultivo basal suplementado con:

- factor de crecimiento de insulina tipo 1 (IGF-1) y factor neurotrófico ciliar (CNTF); y

- suero animal;

c) sembrar la suspensión de células ES obtenida en la etapa b) sobre una capa de células alimentadoras,y cultivar adicionalmente las células ES durante al menos un pasaje;

d) retirar IGF-1 y CNTF del medio de cultivo, y cultivar adicionalmente las células ES aviares durante almenos un pasaje;

e) disminuir progresivamente la concentración de células alimentadoras en el medio de cultivo con el fin deobtener una retirada total de la capa alimentadora después de varios pasajes y cultivar adicionalmente lascélulas;

f) obtener líneas celulares aviares adherentes, derivadas de células ES, capaces de proliferar en un mediobasal en ausencia de factores de crecimiento, y una capa alimentadora, y en donde dichas líneas celularesaviares no producen partículas de retrovirus endógenos competentes para la replicación.

Líneas celulares madre derivadas de embriones de pato para la producción de vacunas virales La presente invención se refiere al desarrollo y a la fabricación de vacunas virales. En particular, la invención se refiere al campo de la producción industrial de vectores y vacunas virales, más específicamente al uso de líneas celulares de pato derivadas de células madre embrionarias que están exentas de retrovirus endógenos de aves, para la producción de vectores y virus virales. La invención es particularmente útil para la producción industrial de vacunas virales para prevenir la infección viral de seres humanos y animales.

Antecedentes Las vacunas reducen y previenen eficazmente la muerte y enfermedades de muchas infecciones virales tales como, por ejemplo, gripe, sarampión, paperas, viruela, fiebre amarilla.

Muchas vacunas virales se producen actualmente en huevos embrionados de pollo o en fibroblastos primarios de embriones de pollo aislados a partir de embriones de pollo. Sin embargo, la producción de vacunas se ha visto ocasionalmente complicada por una contaminación inadvertida con agentes adventicios que pueden proceder de sustratos de células de aves utilizados para propagar cepas de vacunas. De hecho, la actividad de la transcriptasa inversa (RT – siglas en inglés) , una indicación de la presencia de retrovirus, fue detectada en vacunas atenuadas vivas, derivadas de células de pollo, que incluyen las producidas por fabricantes europeos y de Estados Unidos de América para la fiebre amarilla, sarampión y paperas (Hussain et al., 2003, J. Virol 77:1105-1111; Johnson y Heneine, 2001, J. Virol. 75:3605-3612) . Investigaciones del origen de la actividad de la RT en esas vacunas encontraron evidencia de partículas que contenían ARN procedente de virus de la leucosis aviar endógeno (ALV-E) y virus aviar endógeno (EAV) (Johnson y Heneine, 2001, J. Virol. 75:3605-3612; Tsang et al., 1999. J. Virol 73:5843-5851; Weissmahr et al., 1997, J. Virol. 71:3005-3012) .

Tanto ALV-E como EAV son miembros de familias de retrovirus endógenos, presentes en la línea germinal del pollo. ALV-E son expresados a partir de loci ev, que son elementos provirales hereditarios. Basado en sus secuencias de la envoltura, los ALV-E· se diferencian de subgrupos A a D y J de ALV, que son infecciones adquiridas de forma exógena. Mientras que ALVs exógenos provocan varias enfermedades neoplásticas tales como miocarditis y osteopetriosis en pollos infectados, no se conoce que los ALV-E sean patógenos para los pollos. La carencia de un potencial oncogénico con infecciones por ALV-E puede ser atribuida a la ausencia tanto de una actividad de oncogen como de potenciador viral en la repetición terminal larga (LTR – siglas en inglés) endógena. Más de 20 loci ev diferentes han sido identificados en pollos White Leghom (ev-1 a ev-22) . Las designaciones de los loci ev se asignan en el orden descubierto y se clasifican fenotípicamente con respecto a los productos génicos que expresan y a su capacidad de generar partículas infecciosas. Fenotipos de ALV-E conferidos por loci ev oscilan desde partículas infecciosas estructural y enzimáticamente completas a estructural o enzimáticamente defectuosas (RT) a expresión de la proteína viral no detectable. La mayoría de los loci ev son estructuralmente incompletos y, por lo tanto, no codifican todas las secuencias necesarias para la producción de partículas de virus infecciosos. La raza de pollos denominada ev-0 ha sido obtenida mediante la cría de modo que sea resistente a ALV-E. Pollos de la línea 0 carecen de loci ev (es decir ev-0) , pero están presentes secuencias provirales en pollos de la línea 0 del genoma (Dunwiddie y Faras, 1985, Proc Natl. Acad. Sci USA, 82: 5097-5101) .

Poco se conoce sobre la familia de EAV, que es distinta, pero que está relacionada con la familia de ALV. Elementos de EAV están presentes en al menos 50 copias por cada genoma del pollo. Sin embargo, ninguna de las secuencias de EAV conocidas representa genomas retrovirales de longitud completa e intactos, y todavía no se han identificado aislados de EAV infecciosos. Sin embargo, EAV ha demostrado expresarse altamente en células embrionarias derivadas del género aviar, Gallus. Weissmahr et al., (1997, J. Virol 71:3005-3012) han demostrado que partículas procedentes de la familia de retrovirus endógenos EAV son lo más probablemente responsables de una gran parte de la actividad de la RT asociada a las partículas, encontrada en los sobrenadante de fibroblastos embrionarios de pollo cultivados.

El riesgo de una transmisión inadvertida es particularmente elevado para la vacuna de virus atenuados vivos, dado que no pueden ser sometidos a un proceso de inactivación, y la mayoría de ellos son inyectados en el ser humano, por lo tanto pasando mecanismos de protección inmune no específicos. Así, con el fin de garantizar una seguridad de las vacunas para uso animal y humano, los sustratos celulares para la producción de vacunas han de ser ahora sometidos a ensayo en cuanto a la presencia de retrovirus competentes para la replicación que podrían ser transmitidos a hospedadores animales o humanos durante la inmunización (Series de informes técnicos de la OMS, 1994) .

Por otra parte, sistemas de producción de huevos embrionados de pollo y fibroblastos primarios de embriones de pollo están asociados con varias limitaciones serias, que incluyen:

- un proceso de fabricación prolongado, pesado y consumidor de reservas que requiere la adquisición y el control de calidad de grandes cantidades de huevos o CEFs para cada una de las campañas de producción individuales;

- la necesidad en muchos casos de utilizar costosos embriones de pollo libres de patógenos específicos (SPF – siglas en inglés) ;

- los riesgos de un suministro insuficiente de huevos en los casos de infecciones epidémicas en bandadas de pollos donantes;

- los costes inflacionistas asociados con el uso de sueros bovinos que proceden de países exentos de encefalopatía espongiforme bovina (BSE – siglas en inglés) ;

- la incapacidad de utilizar huevos para la propagación de virus que son altamente virulentos y letales para los pollos.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejorar las actuales tecnologías de producción de vacunas virales basadas en huevos o fibroblastos embrionarios de pollo. El desarrollo de plataformas para el cultivo de células como una alternativa a los sistemas de producción de huevos y CEF para la fabricación de vacunas virales es probablemente la solución más rápida y prometedora para superar los cuellos de botella de producción de vacunas y las restricciones de tiempo actuales. Además de ello, el uso de líneas celulares para la fabricación de vacunas virales, en lugar de plataformas de huevos o CEF, tendrían las siguientes ventajas adicionales en relación con la seguridad de la vacuna: ningún aditivo antibiótico presente en la formulación de la vacuna; no se necesita conservante tóxico alguno (tal como tiomersal) ; niveles reducidos de endotoxina, ningún caso de alergia a los huevos; sin riesgo de agente adventicio/BSE por parte del cultivo celular en medios exentos de proteínas y suero; mayor pureza de la preparación de la vacuna de virus.

Ejemplos de líneas celulares para la producción de vacunas virales son MDCK (células derivadas del riñón de perro Madin-Darby) , PerC6 (células derivadas de células de la retina embrionaria humana, genéticamente modificadas al insertar los genes E1 procedentes del adenovirus humano tipo 5) desarrolladas por CRUCELL (Holanda) , VERO (células derivadas de células epiteliales del riñón de mono verde africano (Cercopithecus aethiops) aislado en la Universidad Chiba, en Chiba, Japón) , BHK21 (células inmortalizadas de células de riñón de hámster bebé) . Ninguna de las líneas celulares disponibles cumple todos los requisitos médicos, reguladores e industriales. Por ejemplo, la mayoría de estas líneas celulares son tumorigénicas y existe una importante preocupación reguladora sobre el uso de células tumorigénicas para la producción de vacunas humanas; por lo tanto, hoy en día las autoridades reguladoras son reacias a aprobar sustratos de células tumorigénicas para producir vacunas en masa. Además, algunas de estas líneas celulares son dependientes de anclaje, lo que constituye una importante barrera para la ampliación industrial de la producción de vacunas.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar líneas celulares independientes de anclaje, libres de replicación competente de retrovirus, que sean no tumorigénicas y que sean conformes industrialmente, que sean susceptibles a infección con una amplia gama de virus. Este es el fin de la presente invención.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para obtener líneas celulares aviares diploides continuas, derivadas de células madres embrionarias (ES) aviares, en el que dichas líneas celulares aviares son capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento y capa alimentadora y no producen partículas de retrovirus endógenos competentes para la replicación, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) aislar embrión o embriones de pájaros en una fase del desarrollo en torno a la oviposición, en donde dichos pájaros se seleccionan del orden de los Anseriformes y el genoma de dichos pájaros no contiene secuencias provirales endógenas susceptibles de producir partículas retrovirales endógenas competentes para la replicación;

b) suspender células madres embrionarias (ES) aviares, obtenidas disociando embrión o embriones de la etapa a) en un medio de cultivo basal suplementado con:

- factor de crecimiento de insulina tipo 1 (IGF-1) y factor neurotrófico ciliar (CNTF) ; y

-suero animal;

c) sembrar la suspensión de células ES obtenida en la etapa b) sobre una capa de células alimentadoras, y cultivar adicionalmente las células ES durante al menos un pasaje;

d) retirar IGF-1 y CNTF del medio de cultivo, y cultivar adicionalmente las células ES aviares durante al menos un pasaje;

e) disminuir progresivamente la concentración de células alimentadoras en el medio de cultivo con el fin de obtener una retirada total de la capa alimentadora después de varios pasajes y cultivar adicionalmente las células;

f) obtener líneas celulares aviares adherentes, derivadas de células ES, capaces de proliferar en un medio basal en ausencia de factores de crecimiento, y una capa alimentadora, y en donde dichas líneas celulares aviares no producen partículas de retrovirus endógenos competentes para la replicación.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que después de la etapa e) , la concentración de suero animal en el medio de cultivo se reduce progresivamente con el fin de obtener una retirada total de suero animal después de varios pasajes.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dichas líneas de células aviares adherentes están adaptadas a condiciones de cultivo en suspensión.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la retirada de los factores de crecimiento IGF-1 y CNTF del medio de cultivo en la etapa d) se realiza simultáneamente.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho pájaro es un pato.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho pájaro es un pato de Pekín.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho pájaro es un pato de Muscovy.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el huevo de dicho pato de Muscovy se incuba hasta la madurez antes de aislar el embrión de pato.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas líneas celulares aviares diploides continuas tienen al menos una de las siguientes características:

-una elevada relación núcleo-citoplásmica,

-una actividad de telomerasa endógena,

- un diámetro de alrededor de 10 µm:

-un tiempo de duplicación de la población de alrededor de 30 horas o menos a 37ºC;

-dichas células expresan uno o más marcadores adicionales, seleccionados del grupo que comprende fosfatasa alcalina, SSEA-1, EMA-1, ENS1,

y en el que dichas células no producen partículas de retrovirus endógenos competentes para la replicación.

10. Un procedimiento para la replicación de un virus en una línea de células aviar diploide continua obtenidas mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende las etapas:

a) infectar dichas células aviares con un virus de interés;

b) cultivar dichas células aviares infectadas con el fin de replicar dicho virus;

c) recolectar el virus en el sobrenadante del cultivo celular y/o dentro de dichas células.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho virus se selecciona del grupo que comprende virus de la viruela, ortomixovirus, paramixovirus, virus herpes, hepadnavirus, adenovirus, parvovirus, reovirus, circovirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, birnavirus y retrovirus.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho virus se selecciona del grupo que consiste en:

- un virus de la viruela o un virus de la viruela recombinante, seleccionado entre el grupo que comprende virus vacuna Ankara modificado (MVA) , virus de la vacuna cepa Lister-Elstree, virus

de la vacuna LC16m8, virus de la vacuna CVI78, virus de la viruela del gallo, virus de la viruela del canario (es decir, ALVAC) , NYVAC, virus de la juncopox, virus mynahpox, virus de la viruela de la paloma, virus de la psittacinepox, virus de la viruela de la codorniz, virus de la viruela del gorrión, virus de la viruela del estornino, virus de la viruela del pavo;

- un paramixovirus o un paramixovirus recombinante seleccionado entre el grupo que comprende

virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubeola, virus Sendai, virus respiratorio sincitial (RSV) , para-influenza tipos I y III humana, virus de la peste bovina, virus del moquillo canino, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la para-influenza de pato;

- un ortomixovirus, un ortomixovirus recombinante o un ortomixovirus reordenado, seleccionado

entre virus de la influenza humana, virus de la influenza aviar, virus de la influenza porcina, virus 35 de la influenza equina, virus de la influenza felina;

- un togavirus, preferiblemente seleccionado entre virus Sinbis, virus del bosque Semliki, virus O’nyong’nyong, virus Chikungunya, virus Mayaro, virus del rio Ross, virus de la encefalitis equina del este, virus de la encefalitis equina del oeste, virus de la encefalitis equina venezolana, o un togavirus recombinante de los mismos;

- un retrovirus, seleccionado entre virus de la reticuloendoteliosis, virus de la anemia infecciosa del pato, virus de la necrosis del bazo por parásitos chupadores o un retrovirus recombinante de los mismos;

- un parvovirus de pato o un parvovirus recombinante del mismo;

-un adenovirus, seleccionado entre adenovirus del gallo, adenovirus del ganso, adenovirus del 45 pato y adenovirus de la paloma, o un adenovirus recombinante de los mismos;

- un birnavirus, preferiblemente el virus de la enfermedad bursal infecciosa; y

- un flavivirus, preferiblemente seleccionado entre el virus Dengue, virus de la encefalitis japonesa y virus del oeste del Nilo.

.

13. Un procedimiento para la producción de proteínas y péptidos recombinantes, que comprende las etapas de:

a. modificar genéticamente las líneas celulares aviares diploides continuas obtenidas mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, mediante transfección transitoria o estable de un vector de expresión;

b. seleccionar dichas líneas celulares aviares genéticamente modificads que expresan dichas 10 proteínas o péptidos recombinantes; y

c. purificar los péptidos o proteínas recombinantes.

FIGURA 1B

FIGURA 4A

FIGURA 4B

FIGURA 4C

FIGURA 6B