COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INHIBIR GENES ENDÓGENOS DE INMUNOGLOBULINAS Y PRODUCIR ANTICUERPOS DE IDIOTIPOS HUMANOS TRANSGÉNICOS.

Composiciones y métodos para inhibir genes endógenos de inmunoglobulinas y producir anticuerpos de idiotipos humanos transgénicos Campo de la invención La invención se refiere a animales transgénicos que tienen uno o más loci endógenos de inmunoglobulinas inactivados, y a métodos para producir los mismos. La invención se refiere, además, a composiciones y a métodos de producción de anticuerpos humanizados y totalmente humanos utilizando tales animales transgénicos, y a anticuerpos producidos de este modo. Antecedentes de la invención Los anticuerpos son una clase importante de productos farmacéuticos que han sido empleados con éxito en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos humanos, que incluyen enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedades alérgicas, y el síndrome del injerto frente al huésped, así como también para prevenir el rechazo de los trasplantes. Un problema asociado con la aplicación terapéutica de inmunoglobulinas no humanas es la inmunogenicidad potencial de las mismas en pacientes humanos. Con objeto de reducir la inmunogenicidad de tales preparados han sido desarrolladas diversas estrategias de producción de anticuerpos parcialmente humanos (humanizados) y totalmente humanos. La capacidad de producir en animales anticuerpos transgénicos que posean un idiotipo humano, es particularmente deseable, dado que dentro de la región del idiotipo están situados determinantes antigénicos de unión, y se piensa que los idiotipos no humanos contribuyen a la inmunogenicidad de los compuestos terapéuticos actuales del tipo de anticuerpos. El idiotipo humano es una consideración especialmente importante con respecto a compuestos terapéuticos del tipo de los anticuerpos monoclonales, que consisten en un único idiotipo liberado en una concentración relativamente alta en oposición a la diversidad de idiotipos liberados en concentraciones más bajas por una mezcla de anticuerpos policlonales. Aun cuando se han descrito muchos enfoques para producir anticuerpos transgénicos humanizados en animales han sido descritos, uno de los principales problemas encontrados en muchos de tales enfoques es la producción de anticuerpos endógenos, o bien preferentemente, o bien en combinación con anticuerpos transgénicos del animal hospedador. Varios esquemas de clonación recombinante han sido empleados con el intento de interrumpir la producción de inmunoglobulinas endógenas en animales hospedadores para estudiar este problema. Sin embargo, la inactivación funcional de genes de inmunoglobulina presenta muchos obstáculos en muchas especies de vertebrados. Por ejemplo, aun cuando han sido producidos con éxito ratones mutantes homocigóticos con loci JH suprimidos, usando recombinación homóloga, no se puede disponer con facilidad de células ES u otras células pluripotentes sustentables procedentes de la mayor parte de los vertebrados , en las que pudiera llevarse a cabo recombinación homóloga para inactivar los loci endógenos. Además, las mutaciones que interfieren con la expresión de la superficie celular pero no con la reordenación productiva de segmentos de genes VDJ ó VJ de inmunoglobulinas, son insuficientes para inactivar completamente la expresión endógena de inmunoglobulinas. Esto es puesto de ejemplo por el hecho de que los ratones mutantes homocigóticos con un exón membranal roto de la cadena pesada µ (denominados también ratones µMT) no pueden producir IgM ni IgG, pero producen todavía cantidades importantes de IgA (Macpehrson et al., Nature Immuno 2(7):625-631 (2001). Además, el suero de ratones mutantes heterocigóticos contiene IgM e IgG codificadas por el alelo de tipo salvaje y el alelo de µMT mutado, ambos (Kitamura y Rajewky, Nature 356: 154-156 (1992). Esto es debido al hecho de que la primera reordenación durante el transcurso del desarrollo de células B, es la unión de los segmentos de genes DH y JH sobre ambos cromosomas homólogos, lo que genera una pro-célula B. Si, en los ratones µMT/+, una pro-célula B sufre la unión subsiguiente de VH-DHJH en el locus de IgH mutado y la unión está en el marco de lectura (productivo), la pro-célula B que resulta puede expresar una cadena µ de la forma secretada, pero no puede expresar µ unida a la membrana. Puesto que se requiere la expresión de µ unida a la membrana para la exclusión alélica, una célula tal es capaz todavía de soportar la unión de VH-DHJH en el locus de IgH del tipo salvaje, y si esta segunda reordenación también es productiva, la célula expresa dos cadenas µ diferentes, una de las cuales está unida a la membrana. El suero de tales ratones contiene IgM derivada desde ambos alelos. Además, IgG derivada desde ambos alelos puede encontrarse en el suero de tales ratones debido a que, con frecuencia, es inducido simultáneamente un cambio en ambos loci de IgH de una célula B. También se observa una exclusión alélica incompleta en animales con loci de inmunoglobulinas transgénicos funcionales y loci de inmunoglobulinas endógenas mutadas, que todavía pueden reordenar productivamente segmentos de genes VDJ o VJ. Una célula B que reordene VH-DHJH en uno o ambos loci endógenos mutados todavía puede reordenar productivamente loci de inmunoglobulinas transgénicas. Tal célula B expresa una inmunoglobulina transgénica unida a la membrana y se desarrolla en una célula B madura. Durante el desarrollo de las células B el cambio de isotipo en el locus endógeno mutado puede dar por resultado una célula B que expresa 2   una inmunoglobulina endógena. Por consiguiente, tales mutaciones son insuficientes para la inactivación completa de la expresión de inmunoglobulinas endógenas en animales con loci de inmunoglobulinas transgénicas. Mendez et al., (1997 Nature Genetics, 15. Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody responde in mice) construyeron dos YACs de tamaño de megabases que contenían fragmentos continuos, largos, de los loci de inmunoglobulinas humanas de cadena pesada y de cadena ligera kappa, y los introdujeron en ratones inactivados de Ig para producir anticuerpos humanos. Sumario de la invención La presente invención se refiere a animales transgénicos, a células germinales, a oocitos y a embriones. Sin embargo, no están incluidos en el alcance de la invención los seres humanos, células germinales humanas, oocitos humanos y embriones humanos. Por tanto, la descripción que sigue ha de leerse como excluyente del alcance de protección de tales materias de los seres humanos. Un problema importante asociado con la producción de anticuerpos transgénicos humanizados en animales ha sido la producción o coproducción preferente de anticuerpos endógenos en el hospedador. La presente invención resuelve el problema proporcionando animales transgénicos que albergan al menos un locus artificial de Ig y que carecen de la capacidad de producir inmunoglobulinas endógenas.. Estos animales son sumamente útiles para producir anticuerpos transgénicos humanizados y totalmente humanos. Los métodos utilizados para generar tales animales transgénicos son eficaces en muchas especies, que incluyen especies desde las que células ES o células pluripotentes sustentables no pueden obtenerse con facilidad actualmente y en las que no se llevan a cabo fácilmente ni recombinación homóloga ni alteraciones de genes. La presente invención resulta, en parte, del descubrimiento de que puede usarse una meganucleasa para escindir funcionalmente loci endógenos de inmunoglobulinas para generar animales transgénicos útiles para producir anticuerpos transgénicos humanizados y totalmente humanos. Además, pueden usarse dos meganucleasas distintas que hacen blanco en sitios genómicos distintos, para suprimir eficazmente una gran parte de un locus de inmunoglobulina (hasta varios kb), asegurando con ello la inactivación completa de locus y asegurando, además, que los animales transgénicos portadores de la mutación de la línea germinal no generan células B capaces de producir inmunoglobulinas endógenas. Por consiguiente, en un aspecto la invención proporciona animales transgénicos que comprenden al menos un locus artificial de Ig y que tienen al menos un locus endógeno de Ig inactivado de línea germinal. Los animales usados en la invención son animales pequeños de laboratorio, en particular pájaros, roedores y comadrejas. Los loci artificiales utilizados en la invención comprenden al menos un segmento de gen V humano. En una realización preferida un locus de artificial Ig comprende: (i) una región V que posee al menos un segmento de gen V humano que codifica una línea germinal o una secuencia de aminoácidos de región V humana hipermutada; (ii) uno o más segmentos de gen J; y (iii) uno o más genes de región constante, en los que el locus artificial de Ig es funcional y capaz de experimentar reordenación... [Seguir leyendo]

1.- Un método para producir una célula germinal no humana, viable, que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado, que comprende expresar al menos una meganucleasa en una célula germinal, un oocito o un embrión fertilizado, para generar una célula germinal viable que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado, en el que dicha meganucleasa reconoce una secuencia diana de meganucleasa presente en o proximal a dicho locus endógeno de Ig. 2.- El método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia diana de meganucleasa está presente en o proximal a (a) un segmento de gen J dentro de dicho al menos un locus endógeno de Ig, o (b) un gen de región constante de inmunoglobulina. 3.- El método según la reivindicación 1 que comprende, además, expresar una segunda meganucleasa en dicha célula germinal o dicho oocito o embrión fertilizado, en el que dicha segunda meganucleasa reconoce una segunda secuencia diana de meganucleasa presente en o proximal a dicho locus endógeno de Ig. 4.- El método según la reivindicación 1, en el que dicha célula germinal o dicho oocito o embrión fertilizado, comprende una construcción genómica de expresión de meganucleasa que comprende una región de control de la expresión inducible, unida de modo operable a un ácido nucleico que codifica dicha meganucleasa, y en el que dicha meganucleasa es expresada en dicha célula germinal o dicho oocito o embrión fertilizado induciendo la expresión de dicha construcción genómica de expresión de meganucleasa, en el que, opcionalmente, el método comprende, además, repetir la etapa de inducción de la expresión de dicha construcción genómica de expresión de meganucleasa. 5.- El método según la reivindicación 4, en el que dicha célula germinal o dicho oocito o embrión fertilizado, comprende una segunda construcción genómica de expresión de meganucleasa que comprende una segunda región de control de la expresión inducible, unida de modo operable a un segundo ácido nucleico que codifica una meganucleasa, en el que dicha segunda meganucleasa codificada reconoce una segunda secuencia diana de meganucleasa presente en dicho locus endógeno de Ig, en el que dicho método comprende, además, inducir la expresión de dicho segundo ácido nucleico que codifica una meganucleasa en dicha célula germinal, o en dicho oocito o embrión fertilizado. 6.- Un método para producir un animal transgénico que comprende al menos un locus endógeno de Ig inactivado, de línea germinal, que comprende derivar un animal transgénico desde una célula germinal viable que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado que puede obtenerse por el método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o uno de sus descendientes de la célula germinal, en el que el animal transgénico no es un ser humano 7.- El método según la reivindicación 6, en el que dicha célula germinal viable que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado comprende, además, un locus artificial de Ig, por lo que dicho animal transgénico comprende un locus artificial de Ig. 8.- El método según la reivindicación 6, que comprende, además, introducir un locus artificial de Ig en dicha célula germinal viable que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado, o en uno de sus descendientes, o en un oocito o un embrión fertilizado derivado de ella, por lo que dicho animal transgénico comprende un locus artificial de Ig. 9.- El método según la reivindicación 6, en el que dicha derivación de un animal transgénico desde una célula germinal viable que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado, comprende combinar dicha célula germinal viable o uno de sus descendientes de la célula germinal, con un gameto que comprende un locus artificial de Ig, por lo que dicho animal transgénico comprende un locus artificial de Ig. 10.- El método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho locus artificial de Ig comprende: (i) una región V que tiene al menos un segmento de gen V humano que codifica una secuencia de aminoácidos de región V humana, de línea germinal o hipermutada; (ii) uno o más segmentos de gen J, y (iii) uno o más segmentos de gen de región constante, en el que dicho locus artificial de Ig es funcional y capaz de soportar una reordenación génica y producir una colección de inmunoglobulinas artificiales en un animal transgénico derivado desde dicha célula germinal 11.- El método según la reivindicación 9, en el que dicho gameto tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado. 12.- Una célula germinal viable que tiene al menos un locus endógeno de Ig inactivado, que puede obtenerse mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 13.- Un animal transgénico que comprende una construcción genómica de expresión de meganucleasa, en el que dicha construcción comprende una región de control de la expresión inducible, unida de modo operable a un ácido nucleico que codifica una meganucleasa, y en el que dicha meganucleasa codificada reconoce una secuencia diana de meganucleasa presente en o proximal a un locus endógeno de Ig de dicho animal transgénico, y en el que dicho locus endógeno de Ig ha sido inactivado por la acción de dicha meganucleasa, y en el que, opcionalmente, el 24   genoma de dicho animal transgénico comprende, además, al menos un locus artificial de Ig, en el que el animal transgénico no es un ser humano. 14.- El animal transgénico según la reivindicación 13, en el que dicho animal transgénico carece de un locus endógeno de cadena ligera de Ig funcional, o de un locus endógeno de cadena pesada de Ig funcional. 15.- El animal transgénico según la reivindicación 13, en el que dicho animal transgénico es capaz de producir inmunoglobulinas que poseen un idiotipo humano. 16.- El animal transgénico según la reivindicación 13, en el que dicho animal transgénico carece de un locus de cadena ligera de Ig funcional y comprende un locus artificial de cadena pesada de Ig, y en el que dicho animal transgénico es capaz de producir anticuerpos de cadena pesada solamente. 17.- El animal transgénico según la reivindicación 13, en el que dicho animal transgénico comprende al menos un locus de cadena pesada de Ig con al menos un gen de región C que carece de secuencias que codifican un dominio CH1 funcional y que carece de un locus de cadena ligera de Ig funcional. 18.- Un método para producir anticuerpos, que comprende inmunizar con un inmunógeno el animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17. 19.- Un método para producir anticuerpos de cadena pesada solamente, que comprende inmunizar un animal transgénico según la reivindicación 16 ó 17. 20.- Un método para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende;:(i) inmunizar con un inmunógeno un animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17; (ii) aislar una célula que produce anticuerpos monoclonales desde dicho animal transgénico, en el que dicha célula que produce anticuerpos monoclonales produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno; y (iii) usar dicha célula que produce anticuerpos monoclonales para producir dicho anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno, o usar dicha célula que produce anticuerpos monoclonales para producir una célula de hibridoma que produce dicho anticuerpo monoclonal y usar dicha célula de hibridoma para producir dicho anticuerpo monoclonal. 21.- Un método para producir un anticuerpo monoclonal, que comprende: (i) inmunizar con un inmunógeno el animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17; (ii) aislar una célula que produce anticuerpos monoclonales desde dicho animal transgénico, en el que dicha célula que produce anticuerpos monoclonales produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno; y (iii) aislar desde dicha célula que produce anticuerpos monoclonales un ácido nucleico de anticuerpo monoclonal que codifica dicho anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno; y /iv) usar dicho ácido nucleico de anticuerpo monoclonal para producir dicho anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno, en el que, opcionalmente, dicho anticuerpo monoclonal posee un idiotipo humano. 22.- Un método para producir un anticuerpo monoclonal totalmente humano, que comprende: (i) inmunizar con un inmunógeno el animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17; (ii) aislar una célula que produce anticuerpos monoclonales desde dicho animal transgénico, en el que dicha célula que produce anticuerpos monoclonales produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno; (iii) aislar desde dicha célula que produce anticuerpos monoclonales un ácido nucleico de anticuerpo monoclonal que codifica dicho anticuerpo monoclonal que se une específicamente a dicho inmunógeno; (iv) modificar dicho ácido nucleico de anticuerpo monoclonal para producir un ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo monoclonal totalmente humano; y (v) usar dicho ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo monoclonal totalmente humano para producir el anticuerpo monoclonal totalmente humano codificado. 23.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que comprende expresar dicho anticuerpo. 24.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el método comprende, además, una etapa de purificación de dicho anticuerpo. 25.- El método según la reivindicación 24, en el que el método comprende, además, mezclar los anticuerpos purificados con un excipiente farmacéutico adecuado para administrar a pacientes.   26   27   28   29     31