Anticuerpos anti-TENB2 modificados por ingeniería genética con cisteína, y conjugados de anticuerpo y fármaco.

Un anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína que comprende uno o másaminoácidos de cisteína libres,

anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína quecomprende una secuencia de cadena pesada que comprende:**Fórmula**

y una secuencia de cadena ligera que comprende:**Fórmula**

Anticuerpos anti-TENB2 modificados por ingeniería genética con cisteína, y conjugados de anticuerpo y fármaco

Campo de la invención La invención se refiere, en general, a anticuerpos modificados por ingeniería genética con restos de cisteína reactivos y, más específicamente, a anticuerpos con aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Los anticuerpos modificados por ingeniería genética con cisteína se pueden conjugar con fármacos quimioterapéuticos, toxinas, ligandos de afinidad tales como la biotina y marcadores de detección tales como fluoróforos. La solicitud también describe métodos de uso de anticuerpos y compuestos conjugados de anticuerpo y fármaco para el diagnóstico o el tratamiento in vitro, in situ e in vivo de células de mamífero, o afecciones patológicas asociadas.

Antecedentes de la invención La terapia con anticuerpos se ha establecido para el tratamiento dirigido de pacientes con cáncer, y trastornos inmunológicos y angiogénicos. Los polipéptidos asociados a la transmembrana o a tumores expresados específicamente en la superficie de las células cancerosas en comparación con la/s célula/s normal/es, no cancerosa/s, se han identificado como dianas celulares para el diagnóstico del cáncer y la terapia con anticuerpos. La identificación de dichos polipéptidos de antígenos de la superficie celular asociados a tumores, es decir, antígenos asociados a tumores (AAT) , permite la dirección específica hacia las células cancerosas para su destrucción a través de terapias basadas en anticuerpos.

El uso de conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) , es decir, inmunoconjugados, para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23 (9) :1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4975278) permite la administración específica del resto de fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes farmacológicos no conjugados puede producir niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células tumorales que se deseen eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pág. (15 de marzo de 1986) :603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al., (editores) , pág. 475-506) . Los esfuerzos para mejorar el índice terapéutico, es decir, la eficacia máxima y la toxicidad mínima de los ADC, se han centrado en la selectividad de anticuerpos policlonales (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother, 21: 183-87) y anticuerpos monoclonales (mAb) , así como en las propiedades de unión a fármacos y de liberación de fármacos (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549) . Los restos de fármaco usados en los conjugados de anticuerpo y fármaco incluyen toxinas proteicas bacterianas tales como la toxina de la difteria, toxinas de proteínas vegetales tales como ricina, pequeñas moléculas tales como auristatinas, geldanamicina (Mandler et al., (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19) :1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791) , maitansinoides (EP 1391213: Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:8618-8623) , caliqueamicina (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342) , daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . Los restos de fármaco pueden afectar a los mecanismos citotóxicos y citostáticos, incluyendo la unión a 45 tubulina, la unión a ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando están conjugados con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.

Los péptidos auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina (WO 02/088172) , se han conjugado como restos de fármaco a: (i) anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos de Lewis Y en carcinomas) ; (ii) cAC10 que es específico de CD30 en neoplasias hematológicas (Klussman, et al., (2004) , Bioconjugate Chemistr y 15 (4) : 765-773; Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21 (7) : 778-784; Francisco et al., (2003) Blood 102 (4) : 1458-1465; US 2004/0018194) ; (iii) anticuerpos anti-CD20, tales como rituxán (WO 04/032828) para el tratamiento de los cánceres que expresan el CD20 y trastornos inmunes; (iv) anticuerpo anti-EphB2R 21-19 para el tratamiento del cáncer colorrectal (Mao et al., (2004) Cancer Research 64 (3) :

781-788) ; (v) anticuerpo E-selectina (Bhaskar et al., (2003) Cancer Res. 63:6387-6394) ; (vi) trastuzumab (HERCEPTIN®, US 2005/0238649) ; y (vi) anticuerpos anti-CD30 (WO 03/043583) . En los documentos US 5767237 y US 6124431, se desvelan variantes de auristatina E. En Senter et al, “Proceedings of the American Association for Cancer Research”, volumen 45, Número de sumario 623, presentado el 28 de marzo de 2004, se desvela la monometil-auristatina E conjugada a anticuerpos monoclonales. Los análogos de auristatina MMAE y MMAF se han conjugado con diversos anticuerpos (US 2005/0238649) .

Los medios convencionales de fijación, es decir, la unión a través de enlaces covalentes, de un resto de fármaco con un anticuerpo, generalmente, conducen a una mezcla heterogénea de moléculas en la que los restos de fármaco están unidos a una serie de sitios del anticuerpo. Por ejemplo, los fármacos citotóxicos, por lo general, se han 65 conjugado con anticuerpos a través de los, a menudo numerosos, restos de lisina de un anticuerpo, generando una mezcla heterogénea de conjugados de anticuerpo y fármaco. Dependiendo de las condiciones de reacción, la mezcla heterogénea normalmente contiene una distribución de anticuerpos con de 0 a aproximadamente 8, o más, restos de fármaco unidos. Además, dentro de cada subgrupo de conjugados con una determinada proporción en números enteros de restos de fármaco con respecto al anticuerpo, hay una mezcla potencialmente heterogénea en la que el resto de fármaco se une a varios sitios del anticuerpo. Los métodos analíticos y preparativos pueden no ser

adecuados para separar y caracterizar las moléculas de las especies de conjugados de anticuerpo y fármaco dentro de la mezcla heterogénea resultante de una reacción de conjugación. Los anticuerpos son biomoléculas grandes, complejas y estructuralmente diversas, a menudo con muchos grupos funcionales reactivos. Sus reactividades con reactivos enlazadores y productos intermedios de fármaco y enlazador dependen de factores tales como el pH, la concentración, la concentración de sal y los codisolventes. Además, el proceso de conjugación de múltiples etapas puede no ser reproducible debido a las dificultades en el control de las condiciones de reacción, y la caracterización de los reactivos y productos intermedios.

Los tioles de cisteína son reactivos a pH neutro, a diferencia de la mayoría de las aminas, que están protonadas y son menos nucleófilas cerca del pH 7. Como los grupos tiol libres (RSH, sulfhidrilo) son relativamente reactivos, las 15 proteínas con restos de cisteína suelen existir en su forma oxidada como oligómeros ligados por disulfuro o tienen grupos disulfuro puenteados internamente. Las proteínas extracelulares, en general, no tienen tioles libres (Garman, 1997, “Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press”, Londres, pág. 55) . Los grupos tiol de cisteína de los anticuerpos son generalmente más reactivos, es decir, más nucleófilos, hacia los reactivos de conjugación electrófilos que los grupos amina o hidroxilo de los anticuerpos. Los restos de cisteína se han introducido en las proteínas mediante técnicas de ingeniería genética para formar enlaces covalentes con ligandos o para formar nuevos enlaces disulfuro intramoleculares (Better et al (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bemhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255: Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 98 (15) :8480-8484; US 6248564) . Sin embargo, la ingeniería genética en los 25 grupos tiol de cisteína mediante la mutación de varios restos de aminoácidos de una proteína en... [Seguir leyendo]

5 1. Un anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con aminoácidos de cisteína libres, anticuerpo anti-TENB2 modificado por comprende una secuencia de cadena pesada que comprende: cisteína que comprende uno o más ingeniería genética con cisteína que

y una secuencia de cadena ligera que comprende:

2. El anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de acuerdo con la reivindicación 1, que es producido en bacterias o células CHO. 15

3. El anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo está unido covalentemente a un resto farmacológico de auristatina mediante lo que se forma un conjugado de anticuerpo y fármaco.

4. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 3 que comprende un anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína (Ab) y un resto farmacológico de auristatina (D) , en el que el anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína está unido a través de uno o más aminoácidos de cisteína libres mediante un resto enlazador (L) a D; teniendo el compuesto la Fórmula I:

Ab- (L-D) p I

donde p es 1, 3, 4 o preferentemente 2.

5. El compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 4, en el que L tiene la fórmula:

- Aa-Ww-Yy-

donde:

A es unidad de extensión unida covalentemente a un tiol de cisteína del anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína (Ab) ; a es 0 o 1; cada W es, de manera independiente, una unidad de aminoácido; w es un número entero que varía de 0 a 12;

Y es una unidad espaciadora unida covalentemente al resto farmacológico; e y es 0, 1 o 2.

C3-C8, O- (CH2) r, arileno, (CH2) r-arileno, -arilen- (CH2) r-, (CH2) r- (carbociclilo C3-C8) , (carbociclilo C3-C8) - (CH2) r, heterociclilo C3-C8, (CH2) r- (heterociclilo C3-C8) , - (heterociclilo C3-C8) - (CH2) r-, - (CH2) rC (O) NRb (CH2) r-, - (CH2CH2O) r-, - (CH2CH2O) r-CH2-, - (CH2) rC (O) NRb (CH2CH2O) r-, - (CH2) rC (O) NRb (CH2CH2O) r-CH2-, - (CH2CH2O) rC (O) NRb (CH2CH2O) r-, - (CH2CH2O) rC (O) NRb (CH2CH2O) r-CH2- y - (CH2CH2O) rC (O) NRb (CH2) r-; en las que Rb es H, alquilo C1-C6, fenilo o bencilo; y r es, de manera independiente, un número entero que varía de 1 a 10.

7. El compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 5, en el que Ww es valina-citrulina.

9. El compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 6 u 8, en el que R17 es (CH2) 5 o (CH2) 2.

10. El compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 5 que tiene la fórmula:

11. El compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 4, en el que L es SMCC o BMPEO.

12. El compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 4, en el que D es bien MMAE, que preferentemente tiene la estructura:

donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L; o MMAF, que preferentemente tiene la estructura:

donde la línea ondulada indica el sitio de unión al enlazador L.

13. El anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de la reivindicación 1 o 2, o el

compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde el anticuerpo anti-TENB2 parental está seleccionado de entre un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.

14. El anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de las reivindicación 1 o 2, o el

compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en el que el anticuerpo anti-TENB2 parental es un fragmento de anticuerpo, preferentemente un fragmento Fab.

15. El conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 3, en el que L es MC-val-cit-PAB o MC, SMCC, SPP o BMPEO. 15

16. Un compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco seleccionado de entre las estructuras:

y

en las que Val es valina; Cit es citrulina; p es 1, 2, 3 o 4; y Ab es un anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de la reivindicación 1.

17. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de la reivindicación 1 o el conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 3, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.

18. La formulación farmacéutica que comprende un conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente quimioterapéutico seleccionado de entre letrozol, oxaliplatino, doxetaxel, 5-FU, lapatinib, capecitabina, leucovorina, erlotinib, pertuzumab, bevacizumab y gemcitabina.

19. Un artículo de fabricación que comprende la formulación farmacéutica que comprende un conjugado de anticuerpo y fármaco de acuerdo con la reivindicación 17; un recipiente y un prospecto o etiqueta que indica que el compuesto se puede usar para el tratamiento de cáncer caracterizado por la sobreexpresión de un polipéptido TENB2, en el que el cáncer está seleccionado preferentemente de entre cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de tracto urinario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama o cáncer de colon.

20. Un método de determinación de la presencia de una proteína TENB2 en una muestra sospechosa de contener dicha proteína, comprendiendo dicho método la exposición de dicha muestra a un anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína de la reivindicación 1 y la determinación de la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína TENB2 en dicha muestra, en el que la unión del anticuerpo a dicha proteína indica la presencia de dicha proteína en dicha muestra.

21. El método de la reivindicación 20, en el que el anticuerpo es unido covalentemente a un marcador seleccionado de entre un colorante fluorescente, un radioisótopo, biotina o un ligando de complejación de metales; o en el que dicha muestra comprende una célula sospechosa de expresar dicha proteína TENB2; o en el que dicha célula es una célula de cáncer de próstata, ovario, mama, pulmón o páncreas.

22. Un ensayo para la detección de células cancerosas que comprende:

(a) exponer las células a un compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 3; y

(b) determinar el grado de unión del compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco a las células;

en el que preferentemente las células son células tumorales de próstata, páncreas, pulmón, mama, colon u ovario.

23. Un método de inhibición de la proliferación celular que comprende tratar células tumorales de mamífero en un medio de cultivo celular con un compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco de la reivindicación 3, mediante el que se inhibe la proliferación de las células tumorales, en el que las células tumorales de mamífero son preferentemente células tumorales de ovario.

24. La formulación farmacéutica de la reivindicación 17 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método la administración de la formulación farmacéutica al paciente, en el que preferentemente el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de ovario.

25. La formulación farmacéutica de la reivindicación 24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el método comprende la administración de un agente quimioterapéutico al paciente en combinación con el compuesto

conjugado de anticuerpo y fármaco, donde el agente quimiotereapéutico está seleccionado de entre letrozol, cisplatino, carboplatino, taxol, paclitaxel, oxaliplatino, doxetaxel, 5-FU, leucovorina, erlotinib, pertuzumab, bevacizumab, lapatinib y gemcitabina.

26. Un método para preparar un compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco que comprende un anticuerpo anti-TENB2 modificado por ingeniería genética con cisteína (Ab) de la reivindicación 1 y un resto farmacológico de auristatina (D) , en el que el anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína está unido a través de uno o más aminoácidos de cisteína diseñados por ingeniería genética mediante un resto enlazador (L) a D; compuesto que tiene la Fórmula I:

Ab- (L-D) p I

donde p es 1, 3, 4; comprendiendo método las etapas de:

(a) hacer reaccionar el grupo cisteína diseñado por ingeniería genética del anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína con un reactivo enlazador para formar un producto intermedio de anticuerpo y enlazador Ab-L; y

(b) hacer reaccionar el Ab-L con un resto farmacológico activado D; mediante lo que se forma el conjugado de anticuerpo y fármaco;

o que comprende las etapas de:

(c) hacer reaccionar un grupo nucleófilo de un resto farmacológico con un reactivo enlazador para formar un producto intermedio de fármaco y enlazador D-L; y

(d) hacer reaccionar D-L con un grupo cisteína diseñado por ingeniería genética del anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína; mediante lo que se forma el conjugado de anticuerpo y fármaco;

en el que el método comprende opcionalmente la etapa de expresar el anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína en células de ovario de hámster chino (CHO) .

27. El método de la reivindicación 26 que comprende además la etapa de tratar con un agente reductor el anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína expresado, en el que el agente reductor está seleccionado preferentemente de entre TCEP y DTT.

28. El método de la reivindicación 27 que comprende además la etapa de tratar con un agente de oxidación el anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína expresado, tras el tratamiento con el agente reductor, en el que el agente de oxidación está seleccionado preferentemente de entre sulfato de cobre, ácido deshidroascórbico y aire.