Se describe el empleo de un producto seleccionado entre (i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:

1, relacionada con la proteína viral A238L, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento, (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido, (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica, y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido, construcción génica o dicho vector, en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral para el tratamiento y/o prevención de tumores y cáncer

Agentes anti-tumorales basados en la proteína viral A238L.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con el empleo de polinucleótidos y proteínas relacionados con el gen viral A238L y su producto de expresión, la proteína viral A238L, como agentes antitumorales, útiles para el tratamiento de tumores y cánceres, y con composiciones farmacéuticas que contienen dichos polinucleótidos y proteínas.

Antecedentes de la invención

Tratamiento tumoral

El procedimiento más común para el tratamiento de enfermedades tumorales se basa en el uso de agentes químicos, es decir, la quimioterapia. Estos tratamientos, sin embargo, no actúan de manera selectiva, de forma que no sólo atacan a las células tumorales sino también al tejido sano, el cual queda muy dañado. Por consiguiente, seria muy deseable disponer de nuevos agentes anti-tumorales que reduzcan o eliminen estos efectos y con los cuales se pueda tratar el tumor selectivamente.

Las endostatinas (ES) son inhibidores de la migración de células endoteliales y de la angiogénesis y se ha demostrado que reducen el crecimiento tumoral en modelos animales. Boehm et al. (Boehm T, Folkman J, Browder T, O'Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature. 1997 Nov 27; 390 (6658): 404-7) describen el empleo, como modelo experimental, de ratones a los que se les habían implantado diversos tumores. En los ratones no tratados con ES, dichos tumores crecieron rápidamente, provocando la muerte del animal. En cambio, los ratones tratados con ES después del desarrollo de tumores, se observó una reducción del volumen tumoral hasta alcanzar un tamaño casi microscópico. El tratamiento cíclico con ES de ratones portadores de tumor produjo una regresión completa de los tumores en modelos animales. Sin embargo, ensayos clínicos que se están llevando a cabo con ES no han reportado una inhibición significativa del crecimiento tumoral y raras veces se ha observado regresión tumoral. Desgraciadamente, este no es un ejemplo aislado y otros ensayos clínicos que incluyen diferentes moléculas anti-tumorales también son decepcionantes, a pesar de lo notables que fueron los efectos anti-tumorales en los modelos animales. En este contexto, parece lógico combinar varios agentes anti-tumorales para el tratamiento de tumores.

A pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevos agentes anti-tumorales útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de patologías que cursan con el desarrollo de tumores.

Ahora se ha encontrado, que la proteína A238L del virus de la peste porcina africana puede ser utilizada como agente anti-tumoral, por lo que dicha proteína puede servir de base para el desarrollo de nuevos agentes anti-tumorales.

Proteína A238L

Muchos virus de ADN codifican proteínas que ayudan al virus a evadir el sistema inmune del hospedador. El virus de la peste porcina africana (ASFV, del inglés African swine fever virus) es un virus de ADN bicatenario que codifica una potente proteína inmunosupresora, la proteína A238L. La proteína A238L de ASFV inhibe la activación del factor de transcripción NF-?B así como la actividad de la calcineurina, una fosfatasa regulada por calcio y calmodulina. El mecanismo por el cual se lleva a cabo la inhibición del factor de transcripción NF-?B es aún desconocido, aunque se cree que puede ser mediante la unión de la proteína viral a la subunidad p65 del factor de transcripción.

Durante la infección viral, la proteína A238L de ASFV se expresa como dos formas de peso molecular distinto, una de 28 kDa y otra de 32 kDa. Ambas formas de la proteína A238L se producen a partir de un único ADN complementario (ADNc), lo que sugiere que dicha diferencia en el peso molecular se debe a una modificación post-traduccional de la proteína. Sin embargo, la naturaleza de dicha modificación no es conocida. Ambas formas se producen tras la infección y la de mayor peso molecular, 32 kDa, se acumula en el núcleo celular a largos periodos tras la infección. El virus tiene entonces el potencial de inhibir la activación transcripcional de genes inmunomoduladores dependientes de estas rutas de señalización en células infectadas, tales como macrófagos.

La función de A238L como inhibidora de la actividad fosfatasa de la calcineurina está mediada por la unión directa a la subunidad catalítica de la calcineurina. Dicha proteína se activa produciéndose una liberación de calcio y la unión de la calmodulina.

Compendio de la invención

La invención se basa en que los inventores, han observado que la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, relacionada con la proteína A238L de AFSV, inhibe la proliferación celular y/o la migración de células tumorales in vitro. Asimismo, en experimentos in vivo se ha observado que la expresión de dicha proteína en ratones xenotrasplantados con células tumorales que expresan dicha proteína inhibe el crecimiento tumoral, por lo que dicha proteína, o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, así como un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, pueden ser utilizados como agente terapéutico, en particular, como agente anti-tumoral, en el tratamiento y/o prevención de tumores y cáncer.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un producto seleccionado entre (i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o una variante o fragmento funcionalmente equivalente de la misma; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína, variante o fragmento funcionalmente equivalente, (iii) una construcción génica que comprende dicho polinucleótido, (iv) un vector que comprende dicho polinucleótido o dicha construcción génica, y (v) una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido, construcción génica o dicho vector; y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha proteína es la proteína viral A238L de ASFV. En otra realización particular, dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, el gen A238L que codifica la proteína A238L.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del producto previamente identificado en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para inhibir la proliferación celular o para inhibir la migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende dicho producto previamente identificado.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es una diagrama que muestra la inhibición de la actividad del promotor de la enzima inducible COX-2 por efecto de la proteína A238L tras estimulación de las células (Caco-pcDNA y Caco-A238L) con PMA 15 ng/mL más ionóforo de calcio 1 µM (PMA/Ion). La Figura 1B muestra un gel de electroforesis de la RT-PCR llevada a cabo para detectar el ARNm de específico de COX-2. En la Figura puede observarse la inhibición inducida sobre la expresión del ARNm de COX-2 por la presencia de A238L.

La Figura 2 es una representación gráfica que muestra la síntesis de prostaglandina E₂ (PGE2) en líneas celulares derivadas de células Caco-2 (Caco-pcDNA y Caco-A238L). En dicha representación gráfica puede observarse cómo la síntesis de PGE2 está inhibida en células Caco-A238L (una línea celular que expresa la proteína viral A238L de forma estable).

La Figura 3 es una fotografía que muestra el resultado de un ensayo de proliferación celular in vitro en células que expresan de forma estable la proteína A238L (Caco-A238L) frente a células control Caco-pcDNA.

La Figura 4 es una representación gráfica que muestra la tasa de migración de las células Caco-pcDNA y Caco-A238L en condiciones de reposo (basal) y tras estimulación con PMA/Ion. En las gráficas puede observarse cómo la expresión de A238L inhibe la migración de células tumorales in vitro.

La Figura 5 es un diagrama de barras ilustrativo de que la expresión de la proteína viral A238L en células Jurkat-A238L inhibe la migración celular basal, en condiciones de reposo, con respecto a células Jurkat control (Jurkat-pcDNA) que no expresan dicha proteína...

1. Una composición farmacéutica que comprende un producto seleccionado entre:

un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en el que dicha proteína comprende, o está constituida por, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

4. Empleo de un producto seleccionado entre:

en la elaboración de una composición farmacéutica anti-tumoral.

5. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicha proteína comprende, o está constituida por, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

6. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido comprende, o está constituido por, la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

7. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral es una composición para el tratamiento de un tumor primario.

8. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral es una composición para el tratamiento de la metástasis.

9. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica destinada a su administración por vía oral o parenteral, preferentemente, subcutánea o intratumoral.

10. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que dicha composición farmacéutica anti-tumoral se administra en combinación con otro fármaco adicional.

11. Empleo según la reivindicación 10, en el que dicho fármaco adicional es un fármaco para el tratamiento de un tumor o para el tratamiento del cáncer.

12. Empleo según la reivindicación 10 ú 11, en el que dicho fármaco adicional se administra en forma de una composición farmacéutica separada para su administración simultánea o secuencial a la de dicha composición farmacéutica anti-tumoral.

13. Un método in vitro para inhibir la proliferación celular o para inhibir la migración celular que comprende poner en contacto un cultivo celular con una composición que comprende un producto seleccionado entre: