Método para la detección mejorada de células inmunitarias específicas de antígeno que infiltran el tejido.
Método para la detección mejorada de células inmunitarias específicas de antígeno aisladas de tejidos,
que consiste en los siguientes pasos de procedimiento:
- aislamiento de las células inmunitarias vitales de tejido por técnicas de preparación adecuadas, por ejemplo por extracción enzimática o mecánica,
- determinación del número total de células, por ejemplo se necesitan por cada preparación de estimulación 104 hasta 1,5x106 células,
- tinción previa de las células inmunitarias aisladas con un anticuerpo acoplado a un fluorocromo, que está orientado contra antígenos expresados en las células, p.ej. CD45 o mediante fluorocromos idóneos para la coloración de células vitales, p.ej. carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster, CFDA-SE,
- separación de anticuerpos o fluorocromo no unido a través de los pasos de lavado,
- mezcla de las células inmunitarias teñidas previamente con sangre total heparinizada de la misma persona,
- estimulación de las muestras mezcladas con el antígeno interesante, con o sin la adición de anticuerpos coestimuladores anti-CD49d y anti-CD28; solamente anti-CD49d o solamente anti-CD28,
- incubación durante 30min a 4h a 35 hasta 39°C y 3 hasta 10% de CO2,
- adición de un inhibidor de la secreción, p.ej. Brefeldina A, monensina u otro,
- incubación durante 2 hasta 12 horas a 35 hasta 39°C y 3 hasta 10% de CO2,
- lisis de eritrocitos y fijación de los leucocitos,
- pasos de lavado para el aislamiento de los leucocitos,
- aumento de la permeabilidad de la membrana celular por la adición de una sustancia que aumenta la permeabilidad de membrana celular, p.ej. saponina,
- incubación con anticuerpos marcados con fluorocromo específico contra marcadores de activación, p.ej. anti-CD69, de IFN de anti-IFN-y, durante al menos 10min sobre hielo o a temperatura ambiente o a 35 hasta 39°C,
- pasos de lavado repetidos para la retirada de anticuerpos no unidos,
- análisis de las células en un citómetro de flujo y discriminación de las células inmunitarias del tejido frente a las de la sangre basadas en la señal fluorescente, que se ha usado para la tinción previa, p.ej. fluorocromo del anticuerpo-CD45, CFSE, donde las células reactivas al estímulo se distinguen de las células no reactivas en base a la positividad respecto a los marcadores de activación.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DE2016/000111.
Solicitante: GENOME IDENTIFICATION DIAGNOSTICS GMBH.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: EBINGER STRASSE 4 72479 STRASSBERG ALEMANIA.
Inventor/es: SESTER,MARTINA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/569 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
PDF original: ES-2733002_T3.pdf
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