Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.

Un método para producir una meganucleasa recombinante que tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento alterada que difiere en al menos un par de bases respecto de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-Crel seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:

2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, comprendiendo dicho método:

A. diseñar una secuencia polipeptídica que tiene una similitud de al menos el 85 % con los restos 2-153 de la meganucleasa I-Crel de SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho diseño modificar la secuencia de los restos 2-153 de la meganucleasa I-Crel de SEQ ID NO: 1, en donde (1) se ha alterado la especificidad en la posición -1:

(a) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en C70, L70, Y75, Q75, H75, H139, Q46 y H46;

(b) a una A en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en Y75, L75, C75, Y139, C46 y A46;

(c) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E70, E75, E46 y D46;

(d) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en H75, R75, H46, K46 y R46; o

(e) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación de G46;

y/o (2) se ha alterado la especificidad en una posición -2:

(a) a una A en una hebra codificante 81 mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en V44, I44, L44 y N44;

(b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación de E70;

(c) a una A o una T en una hebra codificante mediante una modificación que comprende C44;

y/o (3) se ha alterado la especificidad en una posición -3:

(a) a una A en una hebra codificante mediante una modificación de C24;

(b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en F68, K24 y R24;

(c) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en M68, C68, L68 y F68;

(d) a una C o una T en una hebra codificante mediante una modificación que comprende Y68; y/o

(4) se ha alterado la especificidad en una posición -4:

(a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E77 y K26;

(b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E26 y R77;

(c) a una C o una T en una hebra codificante mediante una modificación que comprende S77; o

(d) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación que comprende S26, y/o (5) se ha alterado la especificidad en una posición -5:

(a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación que comprende E42;

(b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R42;

(c) a una A o una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en C28 y Q42; o

(d) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en M66 y K66;

y/o (6) se ha alterado la especificidad en una posición -6:

(a) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en 60 C40, I40, V40, C79, I79, V79 y Q28;

(b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E40 y R28; o

(c) a una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R40; y/o

(7) se ha alterado la especificidad en una posición -7:

(a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E38, K30 y R30;

(b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en K38, R38 y E30;

(c) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en I38 y L38; o

(d) a una A o una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende C38; o

(e) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en H38, N38 y Q30;

y/o (8) se ha alterado la especificidad en una posición -8:

(a) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en L33, V33, I33, F33 y C33;

(b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E33 y D33;

(c) a una G en una hebra codificante mediante una modificación que consiste en K33; o

(d) a una A o una C en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R32; o

(e) a una A o una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R33;

y/o (9) se ha alterado la especificidad en una posición -9:

(a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación que comprende E32;

(b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en R32 y K32;

(c) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en L32, V32, A32 y C32;

(d) a una C o una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que 30 consiste en D32 e I32; o

(e) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en S32, N32, H32, Q32 y T32, en el que dicha secuencia polipeptídica no comprende los restos 2-153 de la meganucleasa I-Crel de SEQ ID NO: 1 únicamente con las siguientes modificaciones que alteran la especificidad:

N75, A68/N70/N75, D44/K70/N75, R44/AG8/T70/N75, A44/L70/N75, A44/D68/K70/N75, A44/G68/N75,

K44/T68/G70/N75, D44/N70/N75, A44/T68/S70/N75, R44/N70/N75,

A44/S68/N75, A26, C26, C26/R66, R66, C33,

H33, T68/K70/N75, K70/N75, N70/N75, T70/N75, A70/N75, T44/N75,

A68/K70/N75, N68/K70/N75, G70/N75, SG8/K70/N75, N68/N75, H70/N75,

S70/N75, G68/K70/N75, Q70/N75, Q68/K70/N75, H68/K70/N75, A32, A140,

F33, A30, A44, A38, A44/A140, K32, R32, N33, R33, A68, A33, G33, I33, K33,

L33, P33, Q33, S33, T33, A28, A70, D33, E33, M33, V33 and W33;

y

B. producir una meganucleasa recombinante que comprenda dicha secuencia polipeptídica.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E13164564.

Solicitante: Precision Biosciences.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 302 East Pettigrew Street, Dibrell Building, Suite A-100 Durham, North Carolina 27701 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: HELLINGA,HOMME,W, Smith,James Jefferson, Jantz,Derek.

Fecha de Publicación: 14 de Septiembre de 2016.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N15/90 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma.
C12N9/22 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Ribonucleasas.

PDF original: ES-2602184_T3.pdf

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