Meganucleasas racionalmente diseñadas con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.

Un procedimiento de escisión de un secuencia de reconocimiento diana de ADN bicatenario en una célulaeucariota que comprende:

introducir en dicha célula eucariota

un ácido nucleico que codifica una meganucleasa o

una proteína meganucleasa,

en el que dicha meganucleasa escinde dicha secuencia de reconocimiento diana de ADN bicatenario, y

en el que dicha meganucleasa es una meganucleasa recombinante que comprende:

un polipéptido que tiene al menos el 85% de similitud de secuencias con los residuos 2-153 de lameganucleasa I-CreI de SEC ID Nº: 1,

y que tiene especificidad por un medio sitio de la secuencia 15 de reconocimiento que se diferencia al menos unpar de bases de un medio sitio dentro de una secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-CreIseleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5, en el quela especificidad en la posición -4 ha sido alterada:

(i) a una C en una hebra codificante por una modificación seleccionada del grupo que consiste en I77E yI77S;

(ii) a una G en una hebra codificante por una modificación seleccionada del grupo que consiste en I77R;

(iii) a una T en una hebra codificante por una modificación que comprende I77S; o

(iv) a una A en una hebra codificante por una modificación que comprende I77Q,

con la condición de que no se use embrión humano para fines industriales o comerciales.

Meganucleasas racionalmente diseñadas con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas FINANCIACIÓN GUBERNAMENTAL

La invención fue financiada en parte por las ayudas 2R01-GM-0498712, 5F32-GM072322 y 5 DP1 OD000122 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos de América. Por tanto, el gobierno de EE.UU. puede tener ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de la biología molecular y tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. En particular, la invención se refiere a meganucleasas que no se producen naturalmente racionalmente diseñadas con especificidad de secuencia de reconocimiento de ADN alterada. La invención también se refiere a procedimientos de producción de tales meganucleasas, y a procedimientos de producción de ácidos nucleicos recombinantes y organismos usando tales meganucleasas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La ingeniería del genoma requiere la capacidad para insertar, delecionar, sustituir y manipular de otro modo secuencias genéticas específicas dentro de un genoma, y tiene numerosas aplicaciones terapéuticas y biotecnológicas. El desarrollo de medios eficaces para la modificación del genoma sigue siendo un objetivo principal en la terapia génica, agrotecnología y biología sintética (Porteus y col. (2005) , Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Tzfira y col. (2005) , Trends Biotechnol. 23: 567-9; McDaniel y col. (2005) , Curr. Opin. Biotechnol. 16: 476-83) . Un procedimiento común de inserción o modificación de una secuencia de ADN implica introducir una secuencia de ADN transgénica flanqueada por secuencias homólogas a la diana genómica y seleccionar o cribar un evento de recombinación homólogo satisfactorio. La recombinación con el ADN transgénico se produce raramente, pero puede estimularse por una rotura bicatenaria en el ADN genómico en el sitio diana. Se han empleado numerosos procedimientos para crear roturas de ADN bicatenario, que incluyen tratamientos de irradiación y químicos. Aunque estos procedimientos estimulan eficazmente la recombinación, las roturas bicatenarias están dispersas al azar en el genoma, que puede ser altamente mutagénico y tóxico. Actualmente, la incapacidad para elegir como diana modificaciones génicas para sitios únicos dentro de una referencia cromosómica es un impedimento importante para la satisfactoria ingeniería del genoma.

Un enfoque para alcanzar este objetivo es estimular la recombinación homóloga en una rotura bicatenaria en un sitio diana usando una nucleasa con especificidad por una secuencia que es suficientemente grande para estar presentes en solo un único sitio dentro del genoma (véase, por ejemplo, Porteus y col. (2005) , Nat. Biotechnol. 23: 967-73) . La eficacia de esta estrategia se ha demostrado en una variedad de organismos usando fusiones quiméricas entre un dominio de unión a ADN de dedo de cinc manipulado y el dominio de nucleasa no específico de la enzima de restricción FokI (Porteus (2006) , Mol Ther 13: 438-46; Wright y col. (2005) , Plant J. 44: 693-705; Urnov y col. (2005) , Nature 435: 646-51) . Aunque estas nucleasas de dedo de cinc artificiales estimulan la recombinación específica de sitio, retienen actividad de escisión no específica residual resultante de la regulación por disminución del dominio de nucleasa y frecuentemente se escinden en sitios involuntarios (Smith y col. (2000) , Nucleic Acids Res. 28: 3361-9) . Tal escisión involuntaria puede producir mutaciones y toxicidad en el organismo tratado (Porteus y col. (2005) , Nat. Biotechnol. 23: 967-73) .

Un grupo de nucleasas que se producen naturalmente que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases comúnmente encontrados en los genomas de plantas y hongos puede proporcionar una alternativa de ingeniería del genoma menos tóxica. Tales “meganucleasas” o “endonucleasas de recirculación” están frecuentemente asociadas a elementos de ADN parasíticos, tales como intrones e inteínas de auto-corte y empalme del Grupo 1. Promueven naturalmente la recombinación homóloga o inserción génica en localizaciones específicas en el genoma del huésped produciendo una rotura bicatenaria en el cromosoma, que recluta la maquinaria de reparación de ADN celular (Stoddard (2006) , Q. Rev. Biophys. 38: 49-95) . Las meganucleasas se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de la caja His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan la actividad catalítica y secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan por tener tanto una como dos copias del motivo LAGLIDADG conservado (véase Chevalier y col. (2001) , Nucleic Acids Res. 29 (18) : 3757-3774) . Las meganucleasas de LAGLIDADG con una única copia del motivo LAGLIDADG forman homodímeros, mientras que miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG se encuentran como monómeros. Similarmente, los miembros de la familia GIY-YIG tienen un módulo de GIY-YIG, que tiene 70-100 residuos de longitud e incluye cuatro o cinco motivos de secuencia conservados con cuatro residuos invariantes, dos de los cuales se requieren para la actividad (véase Van Roey y col. (2002) , Nature Struct. Biol. 9: 806-811) . Las meganucleasas de la caja His-Cys se caracterizan por una serie altamente conservada de histidinas y cisteínas sobre una región que engloba varios cientos de residuos de aminoácidos (véase Chevalier y col. (2001) , Nucleic Acids Res. 29 (18) : 3757-3774) . En el caso de la familia de NHN, los miembros se definen pormotivos que contienen dos pares de histidinas conservadas rodeadas por residuos de asparagina (véase Chevalier y col. (2001) , Nucleic Acids Res. 29 (18) : 3757-3774) . Las cuatro familias de meganucleasas están ampliamente separadas entre sí con respecto a elementos estructurales conservados y, por consiguiente, especificidad de secuencias de reconocimiento de ADN y actividad catalítica.

Las meganucleasas naturales, principalmente de la familia LAGLIDADG, se han usado para promover eficazmente la modificación del genoma específica de sitio en plantas, levadura, Drosophila, células de mamífero y ratones, pero este enfoque se ha limitado a la modificación de tanto genes homólogos que conservan la secuencia de reconocimiento de meganucleasas (Monnat y col. (1999) , Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 88-93) como a genomas previamente manipulados en los que se ha introducido una secuencia de (Rouet y col. (1994) , Mol. Cell. Biol. 14: 8096-106; Chilton y col. (2003) , Plant Physiol. 133: 956-65; Puchta y col. (1996) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA

93: 5055-60; Rong y col. (2002) , Genes Dev. 16: 1568-81; Gouble y col. (2006) , J. Gene Med. 8 (5) :616-622) .

La implementación sistemática de la modificación génica estimulada por nucleasas requiere el uso de enzimas manipuladas con especificidades personalizadas para elegir como diana roturas de ADN para sitios existentes en un genoma y, por tanto, ha habido gran interés en adaptar las meganucleasas para promover modificaciones génicas en sitios médicamente o biotecnológicamente relevantes (Porteus y col. (2005) , Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Sussman y col. (2004) , J. Mol. Biol. 342: 31-41; Epinat y col. (2003) , Nucleic Acids Res. 31: 2952-62) .

La meganucleasa I-CreI de Chlamydomonas reinhardtii es un miembro de la familia LAGLIDADG que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma del cloroplasto, y que presenta una diana atractiva para el rediseño de meganucleasas. La enzima natural es un homodímero en el que cada monómero hace contactos directos con 9 pares de bases en la secuencia de reconocimiento de longitud completa. Se han usado técnicas de selección genética para identificar mutaciones en I-CreI que alteran la preferencia de bases en una única posición en esta secuencia de reconocimiento (Sussman y col. (2004) , J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chames y col. (2005) , Nucleic Acids Res. 33: e178; Seligman y col. (2002) , Nucleic Acids Res. 30: 3870-9) o, más recientemente, en tres posiciones en la secuencia de reconocimiento (Arnould y col. (2006) , J. Mol. Biol. 355: 44358) . La superficie de separación de la proteína I-CreI-ADN contiene nueve aminoácidos que se ponen en contacto con las bases de ADN directamente y al menos cinco posiciones adicionales que pueden formar posibles contactos en superficies de separación modificadas. Los documentos WO 2004/067753 y WO 2006 y WO 2006/097853 describen enfoques combinatorios para alterar la especificidad de meganucleasas en aminoácidos directamente poniéndose en contacto con el sitio de unión a ADN. El tamaño de esta superficie... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de escisión de un secuencia de reconocimiento diana de ADN bicatenario en una célula eucariota que comprende:

introducir en dicha célula eucariota un ácido nucleico que codifica una meganucleasa o una proteína meganucleasa, en el que dicha meganucleasa escinde dicha secuencia de reconocimiento diana de ADN bicatenario, y

en el que dicha meganucleasa es una meganucleasa recombinante que comprende:

un polipéptido que tiene al menos el 85% de similitud de secuencias con los residuos 2-153 de la meganucleasa I-CreI de SEC ID Nº: 1, y que tiene especificidad por un medio sitio de la secuencia de reconocimiento que se diferencia al menos un par de bases de un medio sitio dentro de una secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-CreI seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5, en el que la especificidad en la posición -4 ha sido alterada:

(i) a una C en una hebra codificante por una modificación seleccionada del grupo que consiste en I77E y I77S;

(ii) a una G en una hebra codificante por una modificación seleccionada del grupo que consiste en I77R;

(iii) a una T en una hebra codificante por una modificación que comprende I77S; o (iv) a una A en una hebra codificante por una modificación que comprende I77Q,

con la condición de que no se use embrión humano para fines industriales o comerciales.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la meganucleasa recombinante comprende al menos una segunda sustitución que altera la especificidad de aminoácidos correspondiente a una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:

I24C, I24K, I24R, Q26A, K28A, K28C, K28H, K28Q, K28R, K28S, N30E, N30K, N30Q, N30R, S32A, S32C, S32D, S32E, S32H, S32I, S32K, S32L, S32N, S32Q, S32R, S32T, S32V, Y33C, Y33D, Y33E, Y33F, Y33H, Y33I, Y33L, Y33R, Y33V, Q38C, Q38E, Q38H, Q38I, Q38K, Q38L, Q38N, Q38R, S40A, S40C, S40E, S40I, S40Q, S40R, S40V, A42E, A42Q, A42R, Q44A, Q44C, Q44D, Q44E, Q44I, Q44K, Q44L, Q44N, Q44R, Q44T, Q44V, T46A, T46C, T46D, T46E, T46G, T46H, T46K, T46Q, T46R, Y66K, Y66M, R68C, R68E, R68F, R68H, R68K, R68L, R68M, R68Q, R68Y, R70A, R70C, R70D, R70E, R70G, R70H, R70K, R70L, R70Q, R70S, D75C, D75E, D75H, D75L, D75Q, D75R, D75Y, S79A, S79C, S79I, S79V, K139H y K139Y.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de reconocimiento diana de ADN bicatenario está comprendida en un cromosoma de dicha célula eucariota.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende además:

transfectar dicha célula eucariota con una secuencia de ácidos nucleicos que incluye una secuencia exógena, en el que dicha secuencia exógena se inserta en el cromosoma en el sitio de escisión, para así producir una célula eucariota genéticamente modificada que incluye dicha secuencia exógena insertada en dicho cromosoma de dicha célula eucariota,

opcionalmente en el que dicho ácido nucleico comprende además secuencias homólogas a secuencias que flanquean el sitio de escisión y dicha secuencia exógena se inserta en dicho sitio de escisión por recombinación homóloga, o en el que dicho ácido nucleico carece de homología sustancial con el sitio de escisión y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma por unión de extremos no homólogos.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha secuencia diana se altera por unión de extremos no homólogos en el sitio de escisión para así producir una célula eucariota genéticamente modificada que altera la secuencia diana en dicho cromosoma de dicha célula eucariota.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el nucleótido correspondiente a la posición -4 del sitio de reconocimiento de I-CreI ha sido alterado a una C y la primera sustitución de aminoácidos que altera la especificidad se corresponde con una sustitución I77E.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el nucleótido correspondiente a la posición -4 del sitio de reconocimiento de I-CreI ha sido alterado a una C y la primera sustitución de aminoácidos que altera la especificidad se corresponde con una sustitución I77S.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el nucleótido correspondiente a la posición -4 del sitio de reconocimiento de I-CreI ha sido alterado a una G y la primera sustitución de aminoácidos que altera la especificidad se corresponde con una sustitución I77R.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el nucleótido correspondiente a la posición -4 del sitio de reconocimiento de I-CreI ha sido alterado a una T y la primera sustitución de aminoácidos que altera la especificidad se corresponde con una sustitución I77S.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el nucleótido correspondiente a la posición -4 del sitio de reconocimiento de I-CreI ha sido alterado a una A y la primera sustitución de aminoácidos que altera la especificidad se corresponde con una sustitución I77Q.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha célula es una célula de planta.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho ácido nucleico se introduce en dicha célula por un vector de Agrobacterium, inyección balística, bombardeo con microproyectiles o electroporación.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha célula es un protoplasto y dicho ácido nucleico se introduce en dicha célula por transformación mediada por PEG.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha célula es una célula de mamífero.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico se introduce en dicha célula por un adenovirus, un vector de virus adeno-asociado, inyección balística, electroporación, microinyección o transfección de liposomas.