Virus de la fiebre porcina clásica recombinante (VFPC) que comprende una proteína E2 modificada y métodos para generar dicho VFPC recombinante.

Un virus de la peste porcina clásica (VFPC) recombinante infeccioso y de replicación competente,

en el que el genoma parental es el genoma de una cepa C (china) que comprende una deleción de al menos dos aminoácidos en un dominio "TAVSPTTLR" de la proteína E2, correspondiente a las posiciones 829 a 837 de una poliproteína de VFPC parental, en el que dicha deleción comprende una deleción de prolina y de treonina en las posiciones 833 y 834 en dicho dominio "TAVSPTTLR" no seguida de una inserción de aminoácidos en las mismas posiciones, y el virus comprende al menos una alteración adicional en el genoma parenteral para hacer que el virus sea adecuado para su uso como vacuna DIVA.

Virus de la fiebre porcina clásica recombinante (VFPC) que comprende una proteína E2 modificada y métodos para generar dicho VFPC recombinante La invención se refiere a enfermedades animales. Más específicamente, la invención se refiere a un virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) recombinante que comprende una proteína E2 modificada. La invención se refiere adicionalmente a una vacuna que comprende dicho VFPC recombinante que permite diferenciar un animal infectado de un animal vacunado y métodos para generar dicho VFPC recombinante. La invención se expone en las reivindicaciones.

El virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) es un virus de ADN de hebra positiva encapsulado que, junto con el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y el virus de la enfermedad de la frontera (VEF) , comprende el género pestivirus de la familia Flaviviridae (Pringle, 1998. Arch Virol 143: 203-10) . La introducción del VFPC en piaras de cerdos domesticados puede producir enormes pérdidas económicas (Terpstra any de Smit. 2000. Vet Microbiol 77: 3-15) . La vacunación con un virus del VFPC atenuado mediante varios pases en conejos y cultivo celular, las denominadas cepas “chinas” o “C”, tiene como resultado una inmunidad rápida y para toda la vida contra el VFPC virulento. El virus de la cepa C se usa con éxito en todo el mundo y a menudo se hace referencia a él como la vacuna veterinaria más eficaz jamás producida. No obstante, esta vacuna no permite la diferenciación serológica entre animales infectados y vacunados (DIVA) . Esta es una desventaja importante, ya que la incapacidad para detectar animales infectados por FPC en una población vacunada puede imponer restricciones comerciales importantes.

El diagnóstico de FPC en el campo se puede realizar mediante ELISA que detecta anticuerpos dirigidos contra la glicoproteína estructural Erns o E2. Se han desarrollado varias vacunas candidatas que pueden cumplir el criterio 25 DIVA cuando se acompañan del ELISA adecuado, variando de vacunas de subunidades (Hulst et al., 1993. J Virol

67: 5435-42) a virus vivos atenuados (van Gennip et al., 2000. Vaccine 19: 447-59; van Zijl et al., 1991. J Virol 65: 2761-2765) y a vacunas basadas en replicones (van Gennip et al., 2002. Vaccine 20: 1544-56; Widjojoatmodjo et al., 2000. J Virol 74: 2973-2980) .

La vacuna DIVA disponible comercialmente contra la FPC se basa en la E2 producida en baculovirus, que se acompaña de una prueba serológica que detecta anticuerpos dirigidos contra Erns (Van Aarle, 2003. Dev Biol Stand Basel 114: 193-200) . Aunque esta vacuna proporciona protección contra la FPC, es menos eficaz que la vacuna de la cepa C con respecto tanto al inicio como a la duración de la inmunidad (van Oirschot, 2003. Vet Microbiol 96: 36784) . Más importante es el hecho de que los ELISA de Erns que acompañan a esta vacuna también detectan otros miembros del género pestivirus (es decir, el VDVB y el VEF) . Por tanto, su uso no se recomienda en regiones en las que estos virus circulan (2003/265/EC; SANCO/10809/2003) .

Adicionalmente, anteriormente se ha descubierto que la sensibilidad de los ELISA de Erns es insuficiente para diagnosticar animales individuales y, por tanto, solo deberán usarse en rebaños con un número suficientemente grande de animales. 1025-38; Floegel-Niesmann, 2003. Dev Biol (114: 185-91) . Esto explica por qué, en general, los ELISA de E2 son considerablemente preferidos sobre los ELISA de Erns acompañando a una vacuna DIVA.

La proteína E2 contiene dos dominios antigénicos principales, es decir el dominio B/C y el dominio A (van Rijn et al., 1993. J Gen Virol 74: 2053-60; Wensvoort, 1989. J Gen Virol 70: 2865-76) . El dominio A, que se localiza entre los 45 aminoácidos766 y 866 de la poliproteína del VFPC, se divide en los subdominios A1, A2 y A3 (Wensvoort, 1989. J Gen Virol 70: 2865-76) . A pesar del hecho de que el dominio A1 es una diana dominante para los anticuerpos neutralizantes, se ha conservado durante la evolución. De hecho, su conservación de la secuencia e inmunodominancia lo han convertido en la diana dominante en los ELISA de E2.

Aunque los brotes de FPC están actualmente controlados por restricciones de cuarentena y sacrificio de las piaras en las que se sospecha, existe una urgente necesidad de implementar estrategias de intervención más humanas y más económicas para controlar futuros brotes de FPC. Por tanto, existe una urgente necesidad de una vacuna DIVA que se acompañe de un ELISA sólido y específico del VFPC.

La presente invención proporciona un virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) recombinante que comprende una deleción de al menos un aminoácido en el dominio "TAVSPTTLR" de la proteína E2, correspondiente a la posición 829 a 837 de una poliproteína del VFPC parental, como se indica en la reivindicación 1.

Con poliproteína se quiere decir la poliproteína hipotética de aproximadamente 4.000 aminoácidos que se forma tras la traducción del ARN viral. Dicha poliproteína se procesa para formar los productos de escisión finales Npro-C-ErnsE1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.

La proteína E2 del VFPC contiene un epítopo recién identificado que comprende la secuencia de aminoácidos TAVSPTTLR (residuos 829-837 de la poliproteína del VFPC; usando el código de una sola letra para los 65 aminoácidos) (Lin et al., 2000. J Virol 74: 11619-25) . Este epítopo comparte todos los rasgos característicos del dominio A1, siendo inmunodominante, conservado en la evolución, específico del VFPC y una diana para los

anticuerpos neutralizantes. Una comparación de las secuencias alrededor del dominio TAVSPTTLR entre las proteínas E2 de diferentes cepas de pestivirus indica que la secuencia TAVSPTTLR está fuertemente conservadas entre las cepas del VFPC y es altamente variable entre las cepas del VDVB y el VEF (Lin et al., 2000. J Virol 74: 11619-25) .

Los anticuerpos, especialmente los anticuerpos monoclonales, usados en ELISA específicos de E2 que reconocen el dominio TAVSPTTLR no reaccionan de forma cruzada con otros miembros del género pestivirus y, por tanto, se pueden usar en regiones en las que estos otros virus circulan. Dichos anticuerpos no reconocerán un VFPC recombinante de acuerdo con la invención, que comprenden una deleción en dicho dominio de la proteína E2.

Por tanto, dicho virus recombinante permite diferenciar los animales que están infectados por el virus recombinante de los animales que están infectados por el VFPC de tipo silvestre y de los animales que no están infectados y/o que no están vacunados. Adicionalmente, el uso de dicho virus recombinante permitirá el uso de una prueba diagnóstica basada en péptidos para discriminar entre estos animales.

La presente invención proporciona un virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) recombinante que comprende una deleción de al menos un aminoácido en el dominio "TAVSPTTLR" del VFPC, como se indica en la reivindicación 1.

El genoma parental comprende, preferentemente, un genoma viral sustancialmente completo derivado de una cepa del VFPC, preferentemente una cepa de VFPC natural o atenuado recombinante. La expresión genoma parental comprende una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ADN y/o una copia de ADNc de la misma. En la invención, el genoma parental es el genoma de una cepa C (china) .

Con la expresión “deleción de al menos un aminoácido”, como se usa en la descripción, se quiere decir la eliminación de al menos un aminoácido. El término “deleción” no cubre una eliminación de al menos un aminoácido, seguido de la inserción de otro al menos un aminoácido en la misma posición. Por tanto, el término “deleción” como se usa en el presente documento no cubre la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido.

Una molécula de ADNc recombinante como se hace referencia en el presente documento como parte de la divulgación realizada comprende, preferentemente, un genoma del virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) recombinante sustancialmente completo, de modo que dicho genoma codifica una proteína E2 que comprende una deleción de al menos un aminoácido en el dominio "TAVSPTTLR" conservado correspondiente a la posición 829 a 837 de la poliproteína de la FPC. La expresión “sustancialmente complete” indica que dicho virus generado por dicho genoma es capaz de infectar una célula o línea celular adecuada y se puede reproducir en dicha célula o línea celular adecuada. Un genoma viral "sustancialmente completo" preferentemente es un genoma competente para la replicación. Más preferido es un genoma viral infeccioso competente para la replicación competente para el empaquetado. Adicionalmente se prefiere... [Seguir leyendo]

1. Un virus de la peste porcina clásica (VFPC) recombinante infeccioso y de replicación competente, en el que el genoma parental es el genoma de una cepa C (china) que comprende una deleción de al menos dos aminoácidos en un dominio "TAVSPTTLR" de la proteína E2, correspondiente a las posiciones 829 a 837 de una poliproteína de VFPC parental, en el que dicha deleción comprende una deleción de prolina y de treonina en las posiciones 833 y 834 en dicho dominio "TAVSPTTLR" no seguida de una inserción de aminoácidos en las mismas posiciones, y el virus comprende al menos una alteración adicional en el genoma parenteral para hacer que el virus sea adecuado para su uso como vacuna DIVA.

2. El VFPC recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la al menos una alteración adicional es una mutación silenciosa.

3. VFPC recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la mutación silenciosa es una alteración de U a 15 C en la posición 1549 en el gen ERNS .

4. El VFPC recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la al menos una alteración adicional forma un sitio de glicosilación ligada a N en la proteína E2.

5. El VFPC recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha al menos una alteración adicional es una sustitución de ácido aspártico (D) en la posición 774 en la proteína E2.

6. El VFPC recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha al menos una alteración adicional tiene como resultado una glicina (G) en la posición 831 y/o una fenilalanina (F) en la posición 789 y/o una treonina (T) en 25 la posición 445.

7. El VFPC recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una deleción de prolina y treonina en las posiciones 833 y 834, respectivamente, del dominio "TAVSPTTLR" de la proteína E2, que comprende además una alteración de U a C en la posición 1549, un ácido aspártico (D) en la posición 634, una asparagina (N) en la posición 774 en la proteína E2 y una glicina (G) en la posición 831.

8. Una vacuna DIVA de VFPC vivo que comprende un VFPC recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un método para diferenciar los animales infectados con VFPC de animales no infectados o de animales vacunados con la vacuna contra la FPC de la reivindicación 9, que comprende analizar una muestra de suero obtenida de un animal en una prueba serológica.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha prueba serológica es un ELISA basado en péptidos. 40

11. Una molécula de ADNc que comprende un virus de la peste porcina clásica (VFPC) recombinante infeccioso y de replicación competente, en el que el genoma parental es el genoma de una cepa C (china) que comprende una deleción de al menos dos aminoácidos en un dominio "TAVSPTTLR" de la proteína E2, correspondiente a las posiciones 829 a 837 de una poliproteína de VFPC parental, en el que dicha deleción comprende una deleción de 45 prolina y treonina en las posiciones 833 y 834 en dicho dominio "TAVSPTTLR" no seguida de una inserción de aminoácidos en las mismas posiciones, y la molécula comprende al menos una alteración adicional en el genoma parenteral para hacer que el correspondiente virus sea adecuado para su uso como vacuna DIVA.