Variantes de pululanasa con productividad aumentada.

Pululanasa aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.

Variantes de pululanasa con productividad aumentada Campo de la invención

[0001] La invención hace referencia a variantes innovadoras de la pululanasa de péptidos enzimática, las secuencias de genes que codifican dichos péptidos innovadores, vectores de expresión que comprenden esas secuencias de genes así como organismos que expresan las variantes de pululanasa innovadoras. Además, la invención hace referencia al uso de estos péptidos de pululanasa innovadores en el textil, la fermentación, la alimentación y otras industrias.

Antecedentes de la invención

[0002] Las pululanasas son enzimas que se han hallado útiles en numerosas aplicaciones industriales, especialmente en las industrias de la alimentación y las bebidas. Las pululanasas son enzimas desramificantes de almidón y son eficaces en la desramificación de hidrolizados de almidón (útiles en la masa de acondicionamiento), la desramificación de los dextranos límite (3 (útiles en la producción de cervezas y de cervezas tipo ale) y en la producción de jarabes de azúcar a partir de maíz, patata, trigo, yuca y arroz, por ejemplo. Las pululanasas son enzimas clasificadas en EC 3.2.1.41 y tales enzimas se caracterizan por su capacidad de hidrolizar los enlaces glucosídicos a-1,6 en, por ejemplo, amilopectina y pululano.

[0003] Las pululanasas son el producto de bacterias, especialmente del género Bacillus. La producción de pululanasas para uso industrial no está libre de problemas. Las pululanasas se degradan rápidamente mediante diferentes proteasas también producidas por las bacterias, lo que hace que la recuperación de grandes cantidades de pululanasa sea ineficaz y cara. Diferentes personas en el campo han diseñado métodos para aumentar la producción limitando la degradación de pululanasa en el cultivo. Por ejemplo, se ha mostrado previamente que la deleción de los genes AprL y Mpr (que expresaban proteasas) de una cepa de producción de pululanasas era necesaria para la expresión económica de pululanasa activa. Aun así, el tiempo de fermentación está limitado a 51-60 horas para limitar la degradación proteolítica y la pérdida de actividad del producto de pululanasa. Svendsen ha diseñado variantes de pululanasa que modifican la conformación tridimensional de la enzima para aumentar la estabilidad térmica de la enzima o para cambiar la forma en la que la enzima degrada su sustrato (véanse, las patentes estadounidenses 6.350.599 y 6.838.257, así como la solicitud estadounidense n° 2004/0082028).

[0004] Más recientemente, se ha demostrado que el tiempo de degradación de la pululanasa se determinaba con el siguiente resultado: entre 30 y 50 horas se observó un recorte parcial de la molécula de pululanasa de longitud completa en moléculas truncadas que carecían de los aminoácidos N-terminal 98 y 102, respectivamente. El recorte tuvo lugar en el N-terminal de residuos de ácido glutámico E99 y E103, respectivamente y podía visualizarse mediante HPLC. Sorprendentemente, las moléculas de pululanasa truncadas 1-98 y 1-102 retienen actividad de pululanasa y, lo que es más sorprendente, se ha demostrado que esta actividad es superior a la de la pululanasa de longitud completa. Después de 51 horas, una degradación adicional de moléculas de pululanasa tuvo como resultado una caída de la actividad que abolía finalmente toda actividad.

[0005] Aun así, queda espacio para la mejora del diseño de péptidos de pululanasa y las secuencias de nucleótidos que los codifican. Por lo tanto, lo que se necesita son compuestos y métodos para una producción de pululanasa más eficaz mediante, por ejemplo, la limitación de la degradación proteolítica, el aumento de los títulos de fermentación o el aumento de la actividad de pululanasa.

Sumario de la invención

[0006] La presente invención hace referencia a formas nuevas y no evidentes de pululanasa, una enzima péptido. Las pululanasas de la presente invención comprenden modificaciones innovadoras que tienen como resultado un rendimiento superior con respecto a los títulos de producción y/o a la degradación que soporta (p. ej., degradación enzimática mediante proteinasas) y/o son más activos en la descomposición de materiales de sustrato objetivo que los péptidos precursores ("tipo silvestre").

[0007] En este sentido, la presente invención hace referencia a las pululanasas de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, tal y como se muestra en las figuras 8(b) y 9(b), respectivamente. La presente invención también hace referencia a las secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:4 y 6. Las respectivas secuencias de nucleótidos también se muestran en las figuras 8(a) y 9(a) como SEQ ID NO:3 y 5, respectivamente. Tal y como se conoce en la técnica, el código genético es redundante con múltiples codones de nucleótidos que codifican el mismo aminoácido. Por lo tanto, la presente invención hace referencia de forma adicional a cualquier secuencia de nucleótidos alternativa que codifica los péptidos de SEQ ID NO:4 y 6. Un experto en la técnica es capaz de determinar las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de péptidos de la presente invención según la información dada a conocer en la memoria y el conocimiento en la técnica.

[0008] La presente invención hace referencia a construcciones de expresión que codifican los péptidos de la presente invención. La presente invención no está limitada a ninguna construcción de expresión específica siempre que sea capaz de la expresión de los péptidos de la presente invención. En este sentido, los ejemplos no limitativos de construcciones de expresión adecuadas se muestran de forma esquemática en la parte (a) de las figuras 4-6.

[0009] Tal y como se explica con más detalle en las secciones de Descripción Detallada y en los Ejemplos de la presente memoria, la secuencia que codifica el péptido de pululanasa precursor (de Badllus deramificans) se modificó mediante técnicas de optimización de codones para producir una secuencia de nucleótidos con codón optimizado [SEQ ID NO:1] que codifica una copia de la secuencia de aminoácidos de pululanasa de tipo silvestre (es decir, precursora) [SEQ ID NO:2], La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO:2] se clonó con dos orientaciones en el sitio Xho\ del vector de integración de B. licheniformis pICatH que crea las versiones Or¡1 (plCatH-PUL-Or¡1) y Or¡2 (plCatH-PUL-Or¡2) de la construcción de expresión.

[0010] La secuencia que codifica el péptido de pululanasa precursor se modificó para producir un péptido de pululanasa a partir del cual se han eliminado 104 aminoácidos de N-terminal. La secuencia de nucleótidos que codifica esta pululanasa innovadora también se optimizó de codón en una forma de realización, [SEQ ID NO:3], El péptido expresado mediante esta construcción, PULm104, se proporciona en SEQ ID NO:4 (véase, Figura 8(b)). La secuencia de nucleótidos que codifica [SEQ ID NO:4] se clonó con dos orientaciones en el sitio X/rol del vector de integración de B. licheniformis pICatH creando las versiones Ori1 (plCatH-PULm104-Ori1) y Ori2 (pICatH-PUL- Or¡2) de la construcción de expresión.

[0011] En otra forma de realización, la secuencia que codifica el péptido de pululanasa precursor se modificó para reemplazar los residuos de aminoácidos en las posiciones 99 y 103 del ácido glutámico (E) a glutamina (Q) con el fin de hacer que el péptido fuera más resistente a la degradación proteolítica en estas posiciones. La secuencia de nucleótidos que codifica esta pululanasa innovadora también se optimizó de codón en una forma de realización, [SEQ ID NO:5], El péptido expresado mediante esta secuencia de ácido nucleico, PUL_E99Q_E103Q, se proporciona en SEQ ID NO:6. La secuencia de nucleótidos que codifica [SEQ ID NO:6] se clonó con dos orientaciones en el sitio Xho\ del vector de integración de B. licheniformis pICatH creando las versiones Ori1 (plCatH-PUL_E99Q_E103Q-Or¡1) y Or¡2 (plCat-PUL_E99Q_E103Q-Ori2) de la construcción de expresión.

[0012] La presente invención también hace referencia a la transfección de la construcción de expresión de la presente invención en organismos huésped adecuados. La presente invención no está limitada a ningún organismo huésped específico. El organismo huésped puede ser, por ejemplo, un microorganismo, un cultivo de tejido o célula eucariota, un cultivo de tejido o célula vegetal o un cultivo de tejido o célula fúngica. En una forma de realización preferida, el organismo huésped en un microorganismo. Los organismos huésped preferidos incluyen, sin carácter limitativo, Bacillus sp. (esp., Bacillus subtilis, B. licheniformis y B. deramificicans), Escherichia coli, Trichoderma reesei,... [Seguir leyendo]

1. Pululanasa aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6.

2. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una pululanasa de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:5.

4. Construcción de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

5. Construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 donde dicha molécula de ácido nucleico aislada está unida de forma operativa a secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada o transfectada con dicha construcción de expresión.

6. Organismo huésped que comprende la construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Organismo huésped de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho organismo huésped se elige del grupo

consistente en hongos, bacterias y células eucariotas.

8. Organismo huésped de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicho organismo huésped se elige del grupo consistente en Bacillus sp Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger y B. licheniformis.

9. Método para producir una pululanasa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el cultivo de un organismo huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 durante un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para la producción de pululanasa.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende las etapas consistentes en proporcionar una construcción de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y transformar o transfectar dicha construcción de expresión en dicho organismo huésped.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde dicha pululanasa se aísla del cultivo.