Variantes de galactanasas.

Variante de una galactanasa de la familia glicósido hidrolasa 53 original que tiene un cambio en el perfil de la actividad de pH en comparación con la original;

dicha variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones:

H91 N,L,D; A90S+H91D; D181N;

donde la variante tiene actividad de galactanasa;

donde la galactanasa original tiene cualquiera de las SEC ID nº: 1-4;

donde la variante tiene al menos 80% de identidad con la galactanasa original; y

donde la numeración se define por el alineamiento con SEC ID n: 1 utilizando el programa ClustalW con la opción alineamiento de perfil con alineamiento múltiple de la figura 5 como perfil 1, y cualquier secuencia no presente en la fig. 5 como perfil 2 para ser alineado con el primer perfil, usando los parámetros: Parámetros de alineamiento múltiple ≥ Lento/Exacto; Penalización por apertura de espacio ≥ 10,00; Penalización por extensión de espacio ≥ 0,20; Secuencias divergentes de retraso ≥ 30%; Peso de transiciones de ADN: 0,50; Matriz de peso de proteína ≥series Gonnet; Matriz de peso de ADN ≥IUB; Uso matriz negativa ≥ OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar sanciones específicas de residuos ≥ ON; Alternar sanciones hidrofílicas ≥ ON; Residuos hidrofílicos ≥ GPSNDQEKR; Distancia de separación del espacio ≥ 4; Alternar separación de espacio final ≥ OFF.

Variantes de galactanasas Campo de la invención

[1] La presente invención se refiere a variantes de galactanasas de la familia glicósido hidrolasa 53, su producción y su uso en la industria láctea. Antecedentes de la invención

Estado de la técnica

[2] La cristalización y estudios de rayos X preliminares de la galactanasa de Aspergillus aculeatus son descritos por Ryttersgaard et al en Acta.Cryst. (1999), 55, 92993.

[3] La WO 97/3214 A divulga una galactanasa de M. thermophila y una galactanasa de H. insoles.

[4] La WO /47711 A divulga una galactanasa de B. licheniformis.

Resumen de la invención

[5] La invención proporciona una variante de una galactanasa de la familia glicósido hidrolasa 53 original que tiene un cambio en el perfil de la actividad del pH en comparación con la original; dicha variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones: H91 N,L;D; A9S+H91 D; DI8IN;

donde la variante tiene actividad de galactanasa;

donde la galactanasa original tiene cualquiera de las SEC ID n°: 1-4;

donde la variante tiene al menos 8% de identidad con la galactanasa original; y

donde la numeración se define por alineamiento con SEC ID n°: 1 utilizando el programa Clus-talw con la opción

alineamiento de perfil con el alineamiento múltiple de la figura 5 como perfil 1, y cualquier secuencia no presente en la

fig. 5 como perfil 2 para ser alineado con el primer perfil," usando los parámetros: Parámetros de alineamiento múltiple = Lento/Exacto; Penalización por apertura de espacio = 1,; Penalización por extensión de espacio = ,2; Secuencias divergentes de retraso = 3%; Peso de transiciones de ADN: ,5; Matriz de peso de proteína = series Gonnet; Matriz de peso de ADN = IUB; Uso matriz negativa = OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar sanciones específicas de residuos = ON; Alternar sanciones hidrofílicas = ON; Residuos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Distancia de separación de espacio = 4; Alternar separación de espacio final = OFF.

Breve descripción de dibujos

[6]

La fig. 1 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de familia GH 53 de Myceliophthora thermophila con SEC ID n°: 1;

La fig. 2 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de la familia GH 53 de Humicola insolens con SEC ID n°: 2;

La fig. 3 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de la familia GH 53 de Aspergillus aculeatus con SEC ID n°: 3;

La fig. 4 muestra las coordenadas para la estructura 3D de una galactanasa de la familia GH 53 de Baclllus licheniformis con SEC ID n°: 4;

La fig. 5 muestra un alineamiento múltiple de SEC ID n°: 1-4; y

La fig. 6 muestra el alineamiento de la figura 5 con tres secuencias de galactanasa adicionales añadidas.

Descripción detallada de la Invención Determinación de la estructura 3D

[7] La cristalización y los estudios de rayos X preliminares de la galactanasa de Aspergillus aculeatus (AAGAL) son descritos por Ryttersgaard et al. en Acta. Cryst. (1999), 55, 92993. Las galactanasas de Myceliophthora thermophila (MTGAL) y Humicola insolens (HIGAL) (WO 97/3214), y la galactanasa de Bacillus licheniformis (BLGAL) (WO /47711) fueron cristalizadas utilizando principios similares.

[8] Las estructuras 3D se resolvieron conforme a los principios para métodos cristalográficos de rayos X como se dan, por ejemplo, en XRay Structure Determinaron, Stout, G.K. y Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. Las coordenadas estructurales para la estructura cristalina de la galactanasa de Aspergillus aculeatus (AAGAL), como se determina por sustitución ¡somorfa múltiple a 1,8 A resolución en 1 K se dan en la fig. 1 en formato de PDB estándar (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT).

[9] Las estructuras de las otras tres galactanasas se resolvieron por sustitución molecular, usando la estructura AAGAL293 (a 2,3 A resolución en 293K) como modelo de búsqueda. Datos de 2-2,55 A, 18-2,14 A y 19,67-2,6 A se usaron para HIGAL, MTGAL y BLGAL, respectivamente, dentro de AMoRe (J. Navaza: AMoRe: an Automated package for Molecular Replacement. Acta Crystallogr., A5:157163, 1994). Las coordenadas respectivas se dan en las figuras 2- 4 en formato de PDB estándar.

Variante

[1] El término "variante de galactanasa" o simplemente "variante" se refiere a galactanasa que comprende una o más alteración(es), tal como sustitución(es), inserción(es), deleción(es) y/o truncamiento(s) de uno o varios residuos de aminoácidos específicos de una o más posiciones específicas en una galactanasa original.

[11] El número total de tales alteraciones es típicamente no mayor de treinta, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diez, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco, veintiséis, veintisiete, veintiocho, veintinueve, o treinta de dichas alteraciones. Además, la variante de la invención puede incluir otras modificaciones de la enzima original, típicamente no mayor de 1, por ejemplo no mayor de 5 de tales modificaciones.

Nomenclatura y convenios para la designación de variantes

[12] Una sustitución en una variante se indica como "aminoácido original - posición - aminoácido sustituido". Se usa preferiblemente el código de una letra, pero por supuesto se puede traducir en el código de tres letras como se desee. Los códigos X (o Xaa) se pueden utilizar para indicar cualquier residuo de aminoácido. Por consiguiente, la notación "D1 82N" o significa que la vahante comprende una sustitución de ácido aspártico con ácido de asparagina en la posición de aminoácido vahante que corresponde al aminoácido de la posición 182 en MTGAL, cuando los dos se alinean como se Indica en la fig. 5.

[13] Donde el residuo de aminoácido original puede ser cualquier residuo de aminoácido, una notación a mano corta se puede usar a veces Indicando sólo la posición, y el aminoácido sustituido, por ejemplo: "Posición - aminoácido sustituido" o "182N". Esta notación es particularmente importante en relación con la modificación(es) de una serie de polipéptidos homólogos, tales como las galactanasas de la familia GH 53. De forma similar, cuando la identidad de los residuos de aminoácidos de substitución es irrelevante: "aminoácido original - posición" o "D182".

[14] Cuando tanto los aminoácidos originales como los aminoácidos sustituidos pueden ser cualquier aminoácido, entonces sólo se indica la posición, por ejemplo "182".

[15] Cuando los aminoácidos originales y/o aminoácidos sustituidos pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, entonces los aminoácidos se catalogan, separados por comas: "aminoácido original - número de posición - aminoácido sustituido"; por ejemplo "H9ID,L,N".

[16] Varios ejemplos de esta nomenclatura se enumeran a continuación:

La sustitución de ácido aspártico por asparagina en la posición 182 se designa como D182N.

[17] La sustitución de cualquier residuo de aminoácido por serina en la posición 131 se designa como S131X o S131.

[18] La sustitución de prolina por cualquier residuo de aminoácido en la posición 29 se denominaría así X29P o 29P.

[19] Para una modificación donde el o los aminoácidos originales y/o aminoácidos sustituidos pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, la sustitución de ácido aspártico, leucina o asparagina por histidina en la posición 91 se indicaría por H91 D,L,N lo que Indica las vahantes específicas H91 D, H91 L o H91 N.

[2] Una eliminación de ácido glutámlco en la posición 288a se indicará por E288a*. Correspondientemente, la eliminación de más de un residuo de aminoácido, tal como la eliminación de ácido glutámico y ácido aspártico en las posiciones 252a y 252b será designará "E252a*+D252b*".

[21] Un truncamiento se refiere a un encogimiento N o C-terminal de la secuencia de aminoácidos completa, es decir una eliminación de uno, o normalmente más, aminoácidos y el extremo N o C-terminal del péptido. En cuanto a la designación de variantes truncadas, se puede utilizar la regla general para deleciones.

[22] La inserción de un residuo de aminoácido adicional tal como por ejemplo una valina después de F216 se indica por "F216FV"; o, cuando más de un residuo de aminoácido se inserta, tal como por ejemplo una valina, alanina, serina, treonina y una glicina después de F216 se indicará como: "F216FVASTG".

[23] En tales casos el o los residuos de aminoácido insertados se numeran por la adición de letras... [Seguir leyendo]

1. Variante de una galactanasa de la familia glicósido hidrolasa 53 original que tiene un cambio en el perfil de la actividad de pH en comparación con la original; dicha variante comprende al menos una de las siguientes sustituciones: H91 N,L,D; A9S+H91D; D181N;

donde la variante tiene actividad de galactanasa;

donde la galactanasa original tiene cualquiera de las SEC ID n°: 1-4;

donde la variante tiene al menos 8% de identidad con la galactanasa original; y

donde la numeración se define por el alineamiento con SEC ID n: 1 utilizando el programa ClustalW con la opción alineamiento de perfil con alineamiento múltiple de la figura 5 como perfil 1, y cualquier secuencia no presente en la fig. 5 como perfil 2 para ser alineado con el primer perfil, usando los parámetros: Parámetros de alineamiento múltiple = Lento/Exacto; Penalización por apertura de espacio = 1,; Penalización por extensión de espacio = ,2; Secuencias divergentes de retraso = 3%; Peso de transiciones de ADN: ,5; Matriz de peso de proteína =series Gonnet; Matriz de peso de ADN =IUB; Uso matriz negativa = OFF; Parámetros de espacio de proteína: Alternar sanciones específicas de residuos = ON; Alternar sanciones hidrofílicas = ON; Residuos hidrofílicos = GPSNDQEKR; Distancia de separación del espacio = 4; Alternar separación de espacio final = OFF.

2. Variante según la reivindicación 1, donde la vahante comprende al menos una de las siguientes sustituciones: H91 N,L,D.

3. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la vahante comprende al menos las siguientes sustituciones: A9S+H91 D.

4. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la galactanasa original tiene cualquiera de SEC ID n°: 1- 2.

5. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la galactanasa original tiene SEC ID n°: 1.

6. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es una variante de una galactanasa de Myceliophfhora thermofila.

7. Vahante según la reivindicación 1, donde la variante comprende al menos la siguiente sustitución: D181N.

8. Vahante según la reivindicación 7, donde la galactanasa original tiene SEC ID n°: 3.

9. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

1. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 9 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la variante de galactanasa en un huésped de expresión adecuado.

11. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1.

12. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 11.

13. Método para producir una variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el método comprende (a) cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 1-2; y (b) recuperación del polipéptido.

14. Uso de al menos una variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la industria láctea.

15. Uso de al menos una variante de galactanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para preparar galactooligosacáridos y/o para la hidrólisis de lactosa.