Variantes de alfa-amilasa.

Variante de una alfa-amilasa madre de tipo Termamyl, donde

(a) la variante comprende una o varias de las siguientes sustituciones:

E376K; S417T; A420Q o R; S356A; o Y358F y además K176R+I201F+ H205N utilizando la numeración en SEC ID nº: 4, donde la alfa-amilasa madre de tipo Termamyl tiene un grado de identidad para SEC ID nº: 4 de al menos 80%, y

(b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa y además las variantes tienen y una estabilidad aumentada a pH por debajo de 7.0, y/o a concentraciones de calcio por debajo de 1 mM a temperaturas en el rango de 95°C a 160°C relativamente a la alfa-amilasa madre de tipo Termamyl.

Variantes de alfa-amilasa.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a variantes nuevas de a-amilasas madres de tipo Termamyl con propiedades alteradas relativas de la alfa-amilasa madre. Dichas propiedades incluyen mayor estabilidad, p. ej., a pH ácido, p. ej., a concentraciones de calcio bajas y/o a altas temperaturas. Tales variantes son adecuadas para varias aplicaciones, en particular, para el tratamiento del almidón industrial (p. ej., licuefacción de almidón o sacarificación).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las a-amilasas (a-l,4-g1ucan-4-g1ucanohidrolasas, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo-y polisacáridos 1,4-g1 ucosídicos lineales y ramificados.

[0003] Hay un cuerpo muy extenso de patentes y bibliografía científica acerca de esta clase tan importante industrialmente de enzimas. Varias a-amilasas tales como las variantes de a-amilasas del tipo Termamyl son conocidas a partir de, p. ej., WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.

[0004] WO 96/23874 proporciona los datos estructurales por un cristal de rayos X tridimensional para una a-amilasa del tipo Termamyl que consiste en los 300 residuos de aminoácidos N-terminales de la a-amilasa de B. amylolicuefaciens y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos (esta última estando disponible comercialmente bajo el nombre comercial Termamyl), y que está por 10 tanto bastante relacionada con las a-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (las cuales en el presente contexto están comprendidas dentro del significado de los términos "a-amilasas del tipo Termamyl", y las cuales incluyen, entre otras, las a-amilasas de B. licheniformis, B. amylolicuefaciens y B. stearothermophiius). WO 96/23874 además describe la métodología para diseñar, en base a un análisis de la estructura de una a-amilasa del tipo Termamyl, variantes de la a-amilasa del tipo Termamyl las cuales muestran propiedades alteradas relativas a la madre. W096/23873 y W097/41213 divulgan variantes de a-amilasas del tipo Termamyl que tienen propiedades mejoradas seleccionadas, por ejemplo, de estabilidad temporal, de estabilidad de oxidación, de dependencia reducida de Ca+. WO98/26078 divulga variantes de a-amilasas Bacillus amylolicuefaciens con una sustitución en una posición correspondiente a la posición 201.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0005] La presente invención se refiere a variantes de una a-amilasa de tipo Termamyl, donde:

(a) la variante comprende una o más de las siguientes sustituciones: E376K; S417T; A420Q o R; S356A; o Y358F y además K176R+I201F+ H205N utilizando la numeración en SEC ID n°: 4, donde la alfa-amilasa tipo Termamyl madre tiene un grado de identidad para SEC ID n°: 4 de al menos 80%, y

(b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa y además las variantes tienen y una estabilidad aumentada a pH por debajo de 7,0, y/o a concentraciones de calcio por debajo de 1mM a en el rango de temperaturas de 95°C a 160°C relativamente a la alfa-amilasa tipo Termamyl madre. Las variantes son ventajosas en relación con, por ejemplo, el procesamiento industrial de almidón (licuefacción de almidón, sacarificación y similares) como se describe en la patente de EEUU n° 3,912,590 y publicaciones de patentes europeas N°. 252,730 y 63,909.

Conversión del almidón

[0006] Un proceso "tradicional" de conversión del almidón que degrada el almidón a componentes de carbohidratos de peso molecular mas bajo tales como azucares o sustitutos de grasa incluye una fase desramificante.

Conversión de "almidón en azúcar"

[0007] En el caso de convertir el almidón en un azúcar el almidón es despolimerizado. Este proceso de despolimerización consiste en una fase de pretratamiento y dos o tres fases del proceso consecutivas, es decir, un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y dependiendo del producto final deseado opcionalmente un proceso de isomerización.

Pretratamiento del almidón natural

[0008] El almidón natural consiste en gránulos microscópicos que son insolubles en agua a la temperatura ambiente. Cuando se calienta una pasta de almidón acuosa, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento espectacular de la viscosidad. Como el nivel de solidos es del 30-40% en un proceso normalmente industrial, el almidón tiene que ser diluido o "licuado" de modo que pueda ser manipulado. Esta reducción de la viscosidad es hoy principalmente obtenida

por degradación enzimática. Licuefacción

[0009] Durante la fase de licuefacción, el almidón de cadena larga es degradado en unidades más cortas ramificadas y lineales (maltodextrinas) por una a-amilasa (p. ej., Termamyl SEC ID N°: 4 de la presente). El proceso de licuefacción se realiza a 105-110°C durante 5 a 10 minutos seguido de 1-2 horas a 95°C. El pH se encuentra entre 5.5 Y 6.2. Para asegurar una estabilidad enzimática óptima bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones calcio libres). Después de este tratamiento, el almidón licuado tendrá un "equivalente de dextrosa" (DE) de 10-15.

Sacarificación

[0010] Después del proceso de licuefacción, las maltodextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una glucoamilasa (p. ej., AMG) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (patente estadounidense 4.335.208) o una pululanasa (p. ej., Promozyme) (patente estadounidense 4.560.651). Antes de esta fase el pH es reducido a un valor por debajo de 4.5, manteniendo la temperatura alta (por encima de 9S°C) para inactivar la a-amilasa licuefactante para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamados "precursores de panosa" los cuales no pueden ser hidrolizados adecuadamente por la enzima desramificante.

[0011] La temperatura es reducida por debajo de 60°C, y la glucoamilasa y la enzima desramificante son agregadas. El proceso de sacarificación se efectúa durante 24-72 horas.

[0012] Normalmente, cuando se desnaturaliza la a-amilasa después de la fase de licuefacción aproximadamente el 0.2-

0.5% del producto de la sacarificación es el trisacárido ramificado 6 -a-glucosil maltosa (panosa) el cual no puede ser degradado por una pululanasa. Si la amilasa activa de la fase de licuefacción está presente durante la sacarificación (es decir, sin desnaturalización), este nivel puede ser tan elevado como 1-2%, que es muy indeseable puesto que reduce el rendimiento de la sacarificación significativamente.

Isomerización

[0013] Cuando el producto de azúcar final deseado es p. ej. jarabe con alto contenido en fructosa, el jarabe de dextrosa puede ser convertido en fructosa.

[0014] Después del proceso de sacarificación el pH es aumentado hasta un valor en la gama de 6-8, preferiblemente pH 7.5, Y el calcio es eliminado por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en jarabe con alto contenido en fructosa, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme)

[0015] En el contexto de la invención el termino "pH acídico" significa un pH inferior a 7.0, especialmente por debajo de la gama de pH en la que los procesos de licuefacción del almidón industriales son generalmente realizados, según el modo descrito anteriormente, el cual está entre pH 5.5 y 6.2.

[0016] En el contexto de la presente el término "baja concentración de calcio" se refiere a concentraciones por debajo del nivel normal usado en los procesos de licuefacción del almidón industriales tradicionales, como entre 0-40 ppm, preferiblemente entre I0-30 ppm, como entre 15-25 ppm de Calcio. Las concentraciones normales varían dependiendo

de la concentración de Ca + libre en el maíz. Normalmente se añade una dosificación correspondiente a 1 mM (40

ppm) que junto con el nivel de maíz da entre 40 y 60 ppm de Ca + libre.

[0017] En el contexto de la invención el término "temperatura elevada" se refiere a temperaturas entre 95 y 160°C, especialmente a la gama de temperatura en la que los procesos de licuefacción del almidón industriales son normalmente realizados, es decir entre 95 y I05°C.

[0018] La invención también se refiere a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a métodos para preparar las variantes de la invención, y al uso de las variantes de la invención, solas o en combinación con otras enzimas a -amilolíticas, en varios procesos industriales, en particular para la licuefacción del almidón.

Nomenclatura

[0019] En la presente descripción... [Seguir leyendo]

1. Variante de una alfa-amilasa madre de tipo Termamyl, donde

(a) la variante comprende una o varias de las siguientes sustituciones: E376K; S417T; A420Q o R; S356A; o Y358F y además K176R+I201F+ H205N utilizando la numeración en SEC ID n°: 4, donde la alfa-amilasa madre de tipo Termamyl tiene un grado de identidad para SEC ID n°: 4 de al menos 80%, y

(b) la variante tiene actividad de alfa-amilasa y además las variantes tienen y una estabilidad aumentada a pH por debajo de 7.0, y/o a concentraciones de calcio por debajo de 1 mM a temperaturas en el rango de 95°C a 160°C relativamente a la alfa-amilasa madre de tipo Termamyl.

2. Variante según la reivindicación 1, donde la alfa-amilasa madre tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad para SEC ID n°: 4 de al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, de forma más preferible al menos 95%, incluso de forma más preferible al menos 97%, e incluso de forma más preferible al menos 99%.

3. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de alfa-amilasa según la reivindicación 1 o 2.

4. Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 3.

5. Célula que comprende un constructo de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la reivindicación 4.

6. Célula según la reivindicación 5 que es un microorganismo, en particular una bacteria o un hongo.

7. Célula según la reivindicación 6, que es una bacteria gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuríngiensis.

8. Composición de detergente que incluye una variante de alfa-amilasa según la reivindicación 1 o 2.

9. Composición de detergente según la reivindicación 8, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

10. Composición para el lavado manual o automático de vajilla que comprende una variante de alfa-amilasa según la reivindicación 1 o 2.

11. Composición de detergente para el lavado de vajilla según la reivindicación 10, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

12. Composición para el lavado manual o automático de ropa que comprende una variante de alfa-amilasa según la

reivindicación 1 o 2.

13. Composición para el lavado de ropa según la reivindicación 12, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una enzima amilolítica y/o una celulasa.

14. Uso de una variante de alfa-amilasa según la reivindicación 1 o 2 para el lavado y/o el lavado de la vajilla o para desencolado textil o para licuefacción de almidón.