Vacunas contra la gripe multiepitópicas multiméricas.

Un polipéptido multiepitópico multimérico que comprende múltiples copias de una pluralidad de epítopes peptídicos del virus de la gripe dispuestos en una configuración seleccionada de estructura polimérica secuencial alternante (X1X2X3.

.X9)n y una estructura de copolímero de bloques (X1)n(X2)n(X3)n...(X9)n, en el que n es en cada aparición independientemente un número entero de 3-5; y

cada uno de X1-X9 es un epítope peptídico de la gripe diferente seleccionado del grupo que consiste en HA 354-372 correspondiente a E1 y SEC ID Nº: 82, HA 91-108 correspondiente a E2 y SEC ID Nº: 48, M1 2-12 correspondiente a E3 y SEC ID Nº: 25, HA 150-159 correspondiente a E4 y SEC ID Nº: 52, HA 143-149 correspondiente a E5 y SEC ID Nº: 51, NP 206-229 correspondiente a E6 y SEC ID Nº: 64, HA 307-319 correspondiente a E7 y SEC ID Nº: 59, NP 335-350 correspondiente a E8 y SEC ID Nº: 69 y NP 380-393 correspondiente a E9 y SEC ID Nº: 70.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a vacunas basadas en péptidos multiepitópicas multiméricas. En particular, la presente invención se refiere al uso de vacunas basadas en péptidos multiepitópicas multiméricas que provocan inmunidad protectora a la gripe.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Vacunas multiepitópicas Se sabe que los epítopes de linfocitos B, epítopes de linfocitos T colaboradores y epítopes de linfocitos T citotóxicos desempeñan todos funciones importantes en estas dos respuestas inmunitarias. Obviamente, deben inducirse respuestas humorales y celulares de amplio espectro y de larga duración para la eficaz vacunación. Todavía no hay vacunas de amplio espectro y eficaces contra virus con altas velocidades de mutación, tales como el virus de la gripe y el virus de la inmunodeficiencia humana.

Hay una estrecha relación entre la dosis de antígeno y la eficiencia de la respuesta de linfocitos B específica. Estudios usando una proteína transportadora químicamente acoplada y sistema de péptidos epitópicos, que consisten en la misma cantidad de proteína transportadora acoplada a cantidades variables de péptido epitópico, han mostrado que la densidad de epítopes afectó espectacularmente las respuestas de IgG dependientes de linfocitos T colaboradores (Jegerlehner y col., Eur J Immunol. 2002, 32:3305-14) . Liu y col. (Vaccine. 2004 23 (3) :36671) observaron un efecto positivo de la densidad de epítopes sobre la respuesta humoral de ratones y conejos inmunizados con proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa que llevan diversos números de copias del epítope peptídico M2e (1, 2, 4, 8 y 16 copias) de la proteína M2 del virus de la gripe. En el mismo estudio, un ensayo de exposición letal mostró que la proteína de fusión con las mayores densidades de epítopes produjo mayores tasas de supervivencia y pérdidas de peso más lentas.

Se han desarrollado vacunas multiepitópicas, concretamente las vacunas que comprenden más de un epítope, para una amplia variedad de aplicaciones. Una lista no exhaustiva de los ejemplos incluye, por ejemplo, un vacuna multivalente recombinante para bacterias estreptocócicas desvelada en la patente de EE. UU. nº 6.063.386; una vacuna para el tratamiento de malaria que comprende una única proteína que comprende péptidos derivados de diferentes etapas del ciclo de vida del parásito Plasmodium falciparum, desvelada en la patente de EE.UU. nº 6.828.416; composiciones inmunogénicas antitumorales que comprenden un polipéptido que comprende epítopes antigénicos de citoblastos de la próstata, desveladas en la solicitud de patente de EE.UU. 2007/0056315; y vacunas antivirales multiepitópicas contra el VIH (publicación internacional WO 01/24810) , virus de la rubeola (véase la publicación internacional WO 93/14206) y virus de la hepatitis C (publicación internacional WO 01/21189) .

La publicación internacional WO 2006/069262 desvela composiciones, proteínas de fusión y polipéptidos que comprenden patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y epítopes de proteínas del virus de la gripe usadas para estimular respuestas inmunitarias en un sujeto. Los PAMP son motivos moleculares (por ejemplo, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos) encontrados en microorganismos que pueden desencadenar una respuesta inmunitaria innata en un huésped, es decir, actuar de adyuvante. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión incluyen múltiples copias del epítope de la gripe M2e. La publicación internacional WO 2006/078657 desvela proteínas de fusión y polipéptidos similares que comprenden uno o más PAMP y múltiples epítopes de proteínas flavivirales.

Gripe La gripe es una enfermedad producida por virus de tres subtipos principales, gripe A, B y C, que se clasifican según sus determinantes antigénicos. El virión de la gripe consiste en un genoma de ARN monocatenario estrechamente asociado a una nucleoproteína (NP) y envuelto por una envoltura de lipoproteína revestida por proteína de la matriz (M1) y que lleva dos antígenos de glucoproteína de superficie principales, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) . Las glucoproteínas HA y NA son las más susceptibles a cambiar; por ejemplo, hay 16 inmunoclases de HA y 9 clases de NA diferentes que proporcionan la base para los diferentes subtipos del virus de la gripe como H1N1 o H3N2. El virus de la gripe A tienen una glucoproteína de transmembrana adicional, M2, que está altamente conservada entre los diferentes subtipos de HN. El gen M2 codifica una proteína que tiene 96-97 aminoácidos que se expresa como un tetrámero sobre la superficie celular del virión. Está compuesto de aproximadamente 24 aminoácidos extracelulares, aproximadamente 19 aminoácidos de transmembrana y aproximadamente 54 residuos citoplásmicos (Lamb y col., Cell. 1985; 40:627-633) .

Los virus de la gripe A y B son las causas más comunes de la gripe en el hombre. La gripe tiene un enorme impacto sobre la salud pública con graves implicaciones económicas, además de los devastadores problemas de salud, que

incluyen morbilidad e incluso mortalidad. La infección puede ser leve, moderada o grave, que oscila de infección respiratoria superior y traqueobronquitis asintomática a leve a una neumonía viral grave, ocasionalmente letal. El virus de la gripe tiene dos características inmunológicas importantes que suponen un reto a la preparación de vacunas. La primera se refiere a cambios genéticos que se producen en las glucoproteínas de superficie cada algunos años, denominado “desplazamiento antigénico”. Este cambio antigénico produce virus que eluden la resistencia provocada por vacunas existentes. La segunda característica de gran preocupación para la salud pública es que el virus de la gripe, en particular el virus de la gripe A, puede intercambiar material genético y mezclarse. Este proceso, conocido como “desplazamiento antigénico”, produce nuevas cepas diferentes de ambos virus parentales, que pueden ser cepas pandémicas letales.

Antígenos del virus de la gripe y producción de vacunas La inmunización contra el virus de la gripe está limitada por la variación antigénica del virus y por la restricción de la infección a las membranas mucosas respiratorias. Las vacunas contra la gripe actualmente disponibles se basan o bien en virus inactivos completos, en proteínas virales presentadas sobre la superficie de células bacterianas, o bien en determinantes antigénicos virales que llevan flagelina. La HA es un inmunogén fuerte y es el antígeno más significativo en definir la especificidad serológica de las diferentes cepas de virus.

La molécula de HA (75-80 kD) comprende una pluralidad de determinantes antigénicos, varios de los cuales están en regiones que experimentan cambios de secuencia en diferentes cepas (determinantes específicos de cepa) y otros en regiones que están conservadas en muchas moléculas de HA (determinantes comunes) . Debido a estos cambios, las vacunas de la gripe necesitan modificarse al menos cada algunos años.

Se conocen en la técnica muchos antígenos de la gripe, y vacunas preparadas a partir de los mismos. La patente de EE.UU. 4.474.757 desvela una vacuna contra infecciones por el virus de la gripe que consiste en un péptido sintético correspondiente a un fragmento antigénico de HA unido a un vehículo macromolecular adecuado, tal como polímeros de aminoácidos o toxoide tetánico.

La publicación internacional PCT WO 93/20846 por algunos de los inventores de la presente invención enseña una vacuna recombinante sintética contra una pluralidad de diferentes cepas del virus de la gripe que comprende al menos una proteína recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de flagelina y al menos una secuencia de aminoácidos de un epítope del virus de la gripe HA o NP, o un agregado de dicha proteína quimérica. Siguiendo este enfoque, se encontró que una vacuna contra la gripe recombinante sintética basada en tres epítopes era altamente eficaz en ratones. Las vacunas ejemplificadas incluyeron quimeras de flagelina que comprenden el epítope HA 91-108, un epítope de linfocitos B de la HA que está conservado en todas las cepas H3 y provoca anticuerpos neutralizantes contra la gripe, junto con uno o ambos epítopes de linfocitos T colaboradores o CTL NP (NP 55-69 y NP 147-158, respectivamente) , que inducen respuestas inmunitarias limitadas por MHC. Se consideró que una vacuna que comprende una combinación de las tres quimeras anteriormente mencionadas proporciona la principal protección a la infección viral.

La patente de EE.UU. nº 6.740.325 por algunos de los inventores de la presente invención enseña una vacuna contra la... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido multiepitópico multimérico que comprende múltiples copias de una pluralidad de epítopes peptídicos del virus de la gripe dispuestos en una configuración seleccionada de estructura polimérica secuencial

alternante (X1X2X3..X9) n y una estructura de copolímero de bloques (X1) n (X2) n (X3) n... (X9) n, en el que n es en cada aparición independientemente un número entero de 3-5; y cada uno de X1-X9 es un epítope peptídico de la gripe diferente seleccionado del grupo que consiste en H.

35. 372 correspondiente a E1 y SEC ID Nº: 82, H.

9. 108 correspondiente a E2 y SEC ID Nº: 48, M1 2-12 correspondiente a E3 y SEC ID Nº: 25, H.

15. 159 correspondiente a E4 y SEC ID Nº: 52, H.

14. 149 correspondiente a E5 y SEC ID

Nº: 51, N.

20. 229 correspondiente a E6 y SEC ID Nº: 64, H.

30. 319 correspondiente a E7 y SEC ID Nº: 59, N.

33. 350 correspondiente a E8 y SEC ID Nº: 69 y N.

38. 393 correspondiente a E9 y SEC ID Nº: 70.

2. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende:

(i) nueve epítopes peptídicos del virus de la gripe diferentes dispuestos en la siguiente estructura polimérica secuencial alternante [E1E2E3E4E5E6E7E8E9]n, en la que n es 3 ó 5; o (ii) tres repeticiones de nueve epítopes peptídicos del virus de la gripe diferentes dispuestos en la siguiente estructura de copolímero de bloques [E1E1E1-E2E2E2-E3E3E3-E4E4E4-E5E5E5-E6E6E6-E7E7E7-E8E8E8-E9E9E9].

3. El polipéptido según la reivindicación 1 como se expone en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86 y SEC ID Nº: 88.

4. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende además una secuencia de vehículo. 25

5. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido multiepitópico de la gripe según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. El polinucleótido aislado según la reivindicación 5 que codifica una secuencia de polipéptidos seleccionada del

grupo que consiste en: SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86 y SEC ID Nº: 88; o que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85 y SEC ID Nº: 87.

7. Una vacuna para la inmunización de un sujeto contra la gripe que comprende al menos un polipéptido según la reivindicación 1. 35

8. La vacuna según la reivindicación 7, que comprende además un adyuvante.

9. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 para su uso en inducir una respuesta inmunitaria y

conferir protección contra la gripe. 40

10. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de una composición de vacuna para la inmunización contra la gripe.