Vacuna de rotavirus que induce protección cruzada heterotípica.

Uso de una cepa de Rotavirus atenuado de tipo G1P[8] en la fabricación de una composición para conferir protección contra la infección por rotavirus causada por una cepa de rotavirus de tipo G2P[4].

Vacuna de rotavirus que induce protección cruzada heterotípica Campo técnico La presente invención se refiere a formulaciones de vacunas de Rotavirus. La invención se refiere al uso de una población de Rotavirus atenuado de un tipo de Rotavirus en la prevención de una enfermedad asociada a infección por Rotavirus a partir de otro tipo de Rotavirus.

Antecedentes de la técnica La diarrea aguda, infecciosa es una causa principal de la enfermedad y muerte en muchas áreas del mundo. En lospaíses en vías de desarrollo, el impacto de la enfermedad diarreica es asombroso. Para Asia, Ã?frica y Latinoamérica, se ha estimado que existen entre 3 - 4 mil millones de casos de diarrea cada año y de aquellos casos aproximadamente 5 - 10 millones dan como resultado la muerte (Walsh, J.A. y col., : N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979) ) .

Los rotavirus se han reconocido como una de las causas más importantes de diarrea grave en niños pequeños y niños jóvenes (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, tercera edición, editado por Fields y col., Raven Publishers, Philadelphia, 1996) . Se estima que la enfermedad por Rotavirus es responsable de por encima de un millón de muertes anualmente. La enfermedad inducida por Rotavirus lo más comúnmente afecta a los niños entre 6 y 24 meses de edad, y la máxima prevalencia de la enfermedad se produce generalmente durante los meses más fríos en climas templados, y a lo largo del año en áreas tropicales. Los Rotavirus se transmiten típicamente de persona a persona mediante la vía fecal - oral con un período de incubación de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 días. A diferencia de la infección en el grupo de edad de 6 meses a 24 meses, los neonatos son generalmente asintomáticos o tienen solamente la enfermedad leve. En contraste a la grave enfermedad encontrada normalmente en niños jóvenes, la mayoría de los adultos están protegidos como resultado de la infección por Rotavirus previa, de manera que la mayoría de las infecciones de adultos son leves o asintomáticas (Offit, P.A. y col., Comp. Ther., 8 (8) :21 - 26, 1982) .

Los Rotavirus son generalmente esféricos, y su nombre se deriva de su estructura distintiva de la cápside externa e interna o de doble caparazón. Típicamente, la estructura de la cápside de doble caparazón de un Rotavirus encierra un caparazón de proteína interno o núcleo que contiene el genoma. El genoma de un Rotavirus se compone de 11 segmentos de ARN de doble cadena que codifican al menos 11 proteínas virales distintas. Dos de estas proteínas virales designadas como VP4 y VP7 están dispuestas sobre el exterior de la estructura de la cápside de doble caparazón. La cápside interna del Rotavirus presenta una proteína, que es la proteína de Rotavirus designada VP6. La importancia relativa de estas tres proteínas particulares rotavirales en inducir la respuesta inmune que sigue a la infección por Rotavirus no está todavía clara. Sin embargo, la proteína VP6 determina el antígeno del grupo y subgrupo, y las proteínas VP4 y VP7 son las determinantes de la especificidad del serotipo (tipos determinados por el ensayo de neutralización) y genotipo (tipos determinados por un ensayo no serológico) . Las designaciones de los serotipos G y genotipos G son idénticas. Por el contrario, los números asignados para los serotipos y genotipos P son diferentes (Santos N. y Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29 - 56) . Por lo tanto el serotipo P se designa como P seguido de un número asignado, y el genotipo P se designa por una P seguida de un número asignado entre paréntesis.

Hasta la fecha, se han identificado al menos 14 serotipos G de Rotavirus y 14 serotipos P de Rotavirus (Santos N. y Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29 - 56) . Entre éstos, se han identificado 10 serotipos G (G1-6, G8-10 y G12) y 9 serotipos P (P1, P2A, P3, P4, P5A, P7, P8, P11 y P12) entre los Rotavirus humanos. Se han descrito veintitrés genotipos P diez de los cuales se han recuperado de humanos (P[3]-[6], P[8]-[11], P[14] y P[19]) .

La proteína VP7 es una glicoproteína de 38.000 de peso molecular (34.000 de peso molecular cuando no está glicosilada) que es el producto traduccional del segmento genómico 7, 8 ó 9, dependiendo de la cepa. Esta proteína estimula la formación de anticuerpo neutralizante después de la infección por Rotavirus. La proteína VP4 es una proteína no glicosilada de aproximadamente 88.000 de peso molecular que es el producto traduccional del segmento genómico 4. Esta proteína también estimula el anticuerpo neutralizante después de la infección por Rotavirus.

Dado que las proteínas VP4 y VP7 son las proteínas virales contra las que se dirigen los anticuerpos neutralizantes, se cree que son los candidatos principales para el desarrollo de vacunas de Rotavirus, produciendo protección contra enfermedad por Rotavirus.

La infección natural por Rotavirus durante la infancia temprana se sabe que induce una inmunidad protectora.

Una vacuna de Rotavirus atenuado vivo es de este modo altamente deseable. De forma adecuada ésta debe ser una vacuna oral, ya que ésta es la vía natural de la infección del virus.

El desarrollo temprano de vacunas para prevenir infecciones por Rotavirus comenzó en los años 70 después del descubrimiento del virus. Inicialmente, cepas atenuadas de animales y seres humanos se estudiaron y había resultados mixtos o decepcionantes. Los esfuerzos más recientes se han centrado en virus reagrupados de seres humanos - animales que han sido más exitosos.

Una cepa de Rotavirus conocida como 89-12 ha sido descrita por Ward; véase la patente de Estados Unidos Nº

5.474.773 y Bernstein, D.L. y col., Vaccine, 16 (4) , 381 - 387, 1998. La cepa 89-12 se aisló de una muestra de deposición recogida de un niño de 14 meses de edad con enfermedad por Rotavirus natural en 1988. De acuerdo con la patente de Estados Unidos nº 5.474.773 el Rotavirus HRV 89-12 humano se adaptó después en cultivo mediante 2 subcultivos en células primarias de riñón de mono verde africano (AGMK) y 4 subcultivos en células MA104 como describe Ward en J. Clin. Microbiol., 19, 748 - 753, 1984. Después se purificó en placa 3 veces en células MA-104 (hasta el subcultivo 9) y se desarrollaron después de 2 subcultivos adicionales en estas células. Se realizó un subcultivo adicional (pase 12) para deposición con la ATCC con el número de acceso ATCC VR 2272. La cepa depositada se conoce como 89-12C2.

El artículo de 1998 en Vaccine, de Bernstein y col, se menciona más adelante como el artículo de Vaccine (1998) . El artículo describe la seguridad e inmunogenicidad de un candidato de vacuna de Rotavirus humano vivo administrado por vía oral. Esta vacuna se obtuvo a partir de la cepa 89-12, atenuada mediante subcultivo sin purificación en placa 26 veces en células de AGMK primarias y después otras 7 veces en una línea celular de AGMK establecida (33 subcultivos en total) .

De aquí en adelante en la presente memoria descriptiva, el material anteriormente mencionado que ha sido subcultivado en serie 26 veces se denominará P26 y el material que ha sido subcultivado en serie 33 veces se denominará P33. En general, el Rotavirus derivado mediante subcultivo de 89-12 n veces se denominará Pn.

En los ejemplos que siguen, el material P33 se subcultivó 5 veces más sobre células Vero. Esto se denomina P38.

Los aislamientos P26 y P33 descritos en el artículo Vaccine (1998) no se depositaron en una colección de cultivos, ni se analizaron para establecer su caracterización genética.

Ahora, se ha encontrado que la población P26 descrita en la bibliografía comprende una mezcla de variantes. Esto se ha establecido mediante caracterización genética como se describe en la presente memoria descriptiva más adelante (véanse los ejemplos) . P26 no es por lo tanto una población consistente fidedigna para subcultivos posteriores, en particular para la producción de lotes de vacuna. De manera similar, P33 comprende una mezcla de variantes y no es de manera fidedigna consistente para la producción de lotes de vacunas.

Se ha encontrado que el material P26 es una mezcla de al menos tres variantes de genes de VP4. P33 y P38 son de manera similar una mezcla de dos variantes. Estas variantes parece que son antigénicamente diferentes, en términos de epítopos neutralizantes, a la cepa 89-12C2 depositada en la ATCC cuando se evaluaban los títulos del anticuerpo neutralizante de sueros de niños vacunados con P33 contra estas variantes.

Además se ha encontrado que cuando el material P33 se administra a niños, dos variantes identificadas se replicaron y se excretaron. De 100 niños vacunados, solamente 2 mostraron... [Seguir leyendo]

1. Uso de una cepa de Rotavirus atenuado de tipo G1P[8] en la fabricación de una composición para conferir protección contra la infección por rotavirus causada por una cepa de rotavirus de tipo G2P[4].

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la composición comprende un Rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, al menos uno de los siguientes: una base adenina (A) en la posición 788, una base adenina (A) en la posición 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón iniciación.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el gen VP4 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una base adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una base timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en el que la composición comprende un Rotavirus que tiene un gen VP7 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, al menos uno de los siguientes: una timina

(T) en la posición 605, una adenina (A) en la posición 897 y una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que el gen VP7 comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) o una guanina (G) en la posición 897 desde el codón de iniciación.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición comprende un Rotavirus que tiene un gen VP4 que comprende, en la secuencia de nucleótidos, una adenina (A) en las posiciones 788 y 802 y una timina (T) en la posición 501 desde el codón de iniciación; y en el que el gen VP7 comprende, en la secuencia de nucleótidos, una timina (T) en la posición 605 y una adenina (A) en la posición 897 desde el codón de iniciación.

7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición confiere además protección contra al menos uno de los serotipos no-G1 seleccionados del grupo que cosiste en; G3, G4 y G9.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende una cepa de rotavirus atenuado de G1P[8] que proporciona protección contra gastroenteritis grave inducida por rotavirus que tiene una puntuación igual o superior a 11 en la escala de Vesikari causada por infección de una cepa de rotavirus de un tipo G2P[4].

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la composición que comprende una cepa de Rotavirus atenuado de un tipo G1P[8] es al menos un 40 % protectora, en una población de individuos vacunados contra la diarrea provocada por una cepa de Rotavirus que es de tipo G2P[4].

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la composición es al menos un 50 % protectora.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la composición es entre 40 % y 80 % protectora.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la composición es entre 50 % y 70 % protectora.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la composición es entre 40 % y 75 % protectora en una población de individuos vacunados contra la gastroenteritis grave que tienen una puntuación igual o superior a 11 en la escala de Vesikari causada por infección de Rotavirus con un serotipo G2P[4].

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la cepa de Rotavirus en dicha composición es ECACC depósito 99081301, o se puede obtener o derivar de ECACC depósito 99081301.

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la composición es administrada en un régimen de 2 dosis.

16. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la cepa de Rotavirus atenuado es formulada con un vehículo farmacéutico adecuado o con un tampón antiácido o ambos.

17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la composición es para conferir protección en un sujeto humano.

FIG. 1A secuencia VP4 de P43 FIG. 1B secuencia VP4 de P43 (RIX4414 VP4; 2359 pb) Fig. 2A secuencia VP7 de P43

Fig. 2B secuencia VP7 de P43 - (RIX4414 VP7; 1046 pb)

Figur.

3. Secuencia de polipéptidos de P43 VP4. (RIX4414 VP4.pro; 775 aa)

Figur.

4. Secuencia de polipéptidos de P43 VP7 (RIX4414 VP7.pro; 326 aa) . Figur.

5. Secuencia de polipéptidos de la proteína NSP4 de RIX4414 (175 aa) .

Figur.

6. Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NSP4 de RIX4414 (750 pb) . Figur.

7. Secuencia de polipéptidos de la proteína VP6 de RIX4414 (397 aa) .

Figur.

8. Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP6 de RIX4414 (1356 pb) .