Uso de un agente reticulante de anhídrido bismaleico para la fijación de una muestra de célula o tejido.

Un procedimiento para la fijación de una muestra de célula o tejido in vitro en el que dicha muestra de célula o tejido se incuba con un anhídrido bismaleico según la fórmula I**Fórmula**

en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo consistente en hidrógeno,

metilo, etilo, propilo, isopropilo y butilo,

en la que X es un ligador de entre 1 y 30 átomos de longitud

con el que se fija dicha muestra de célula o tejido.

Uso de un agente reticulante de anhídrido bismaleico para la fijación de una muestra de célula o tejido Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a anhídridos bismaleicos novedosos. Se refiere especialmente al descubrimiento de que pueden usarse agentes reticulantes de anhídrido bismaleico para la conservación/fijación de una muestra de célula o tejido. Puede usarse con gran ventaja un agente reticulante de anhídrido bismaleico en procedimientos que requieran la fijación de una muestra de célula o tejido y que requieran al mismo tiempo que el fijador tenga poco impacto sobre la detección posterior de una proteína o ácido nucleico en procedimientos como inmunohistoquímica, hibridación fluorescente in situ o PCR-TR. Se demuestra también que el uso de un agente reticulante de anhídrido bismaleico como fijador facilita en gran medida la detección posterior de un analito de interés en una muestra de célula o tejido anteriormente fijada.

Hasta la fecha, no hay un modo generalmente aplicable ideal para preparar una muestra de célula o tejido, p.ej., para inmunohistoquímica o detección de un ácido nucleico de interés, respectivamente. La fijación y la reversibilidad de los efectos negativos introducidos por la fijación tienen un gran impacto sobre la detectabilidad de los antígenos polipeptídicos y ácidos nucleicos, respectivamente, y sobre la reproducibilidad de los resultados obtenidos a continuación.

Para una inmunotinción exitosa de un antígeno en una muestra de célula o tejido tienen que cumplirse al menos tres criterios: a) retención del antígeno en su sitio original, b) accesibilidad del antígeno y c) conformación/conservación correcta del antígeno/epítopo de interés. Parecería que actualmente ningún procedimiento de fijación y/o detección cumple completamente todos estos tres criterios. Para los procedimientos conocidos en la materia, una mejor actuación para uno o dos de estos criterios es a expensas de una actuación reducida para al menos uno de los otros criterios.

Están disponibles varios fijadores y se usan rutinariamente en un laboratorio de patología clínica, como glutaraldehído, formaldehído y acetona u otros disolventes orgánicos. La amplia mayoría de los procedimientos de fijación, sin embargo, están basados en el uso de agentes reticulantes como formaldehído. La solución fijadora es habitualmente una solución acuosa de formaldehído que contiene fosfatos de sodio, elaborada para proporcionar tamponación (cambio mínimo de pH después de la adición de una cantidad pequeña de ácido o base fuerte) a pH 7,2-7,6 y una solución aproximadamente isotónica (una cuya presión osmótica es la misma que la de los fluidos extracelulares de mamíferos, basada a menudo en solución salina fisiológica).

Con los procedimientos del estado de la materia, la fijación tiene que ser idónea.

Si la fijación es demasiado corta, en lugar de fijación aparece simplemente coagulación de proteínas por los alcoholes usados para deshidratar la muestra. Esto puede incidir negativamente, por ejemplo, en la conservación de la morfología del tejido o perjudicar la estabilidad del almacenamiento a largo plazo.

Con una fijación con formaldehído prolongada, las moléculas de proteína reticuladas forman una red densa que puede perjudicar la penetración de cera parafina y/o el acceso de moléculas de anticuerpo. Como resultado, puede enmascararse reversible o incluso irreversiblemente un antígeno de interés. Adicionalmente, puede modificarse químicamente (destruirse) un epítopo, p.ej., mediante reacción con formaldehído.

Además, es conocido que la actividad de la mayoría de enzimas se perjudica después de fijación con formaldehído.

Como se menciona anteriormente, la fijación con formaldehído es la más ampliamente usada en patología clínica. La razón principal es lo más probablemente que mediante fijación con formaldehído se atrapa el antígeno de interés en los sitios que ocupa en el organismo vivo. Mediante puentes metileno introducidos tras la fijación con formaldehído, se conserva bien también la morfología de una muestra de célula o tejido. Estos efectos positivos, sin embargo, son a expensas de la permeabilidad de la muestra y de que la fijación causa cambios en la accesibilidad y/o conformación de un antígeno/epítopo de Interés, daño en los ácidos nucleicos e inactivación de la actividad enzimática.

La reticulación debida a fijación con formaldehído es probable que enmascare o destruya epítopos, conduciendo a una inmunotinción falsa negativa. Este fallo es aún más probable que aparezca cuando el inmunorreactivo primario es un anticuerpo monoclonal que cuando se usa un antisuero policlonal. Esto es por lo que se han hecho muchísimos Intentos, que se encuentran en la bibliografía relevante, de tratar de revertir los efectos de la fijación con formaldehído.

Para almacenamiento a largo plazo, habitualmente tiene que deshidratarse una muestra de célula o tejido fijada y embeberse en un medio de imbibición apropiado. La Imbibición con parafina es habitualmente preferible a la imbibición con plástico o a cortar especímenes no embebidos con un micrótomo vibratorio o un criostato.

Como se ilustra anteriormente, todos los procedimientos de fijación representan en cierta medida compromisos de diversas clases. A menudo, la conservación óptima de la morfología es a expensas de la accesibilidad para un anticuerpo o la destrucción de un antigeno o un epitopo en el mismo.

Sin embargo, y es también importante para la presente invención, no solo se introduce una alta variabilidad durante la preparación de un espécimen, como su fijación o procesamiento adicional como imbibición con parafina, sino que probablemente se causa aún más variabilidad por los diversos modos y vías de recobrar la reactividad inmunológica o accesibilidad en la detección de ácidos nucleicos, concretamente en procedimientos conocidos como recuperación de antígeno.

A pesar del amplio uso y gran utilidad de los procedimientos, p.ej. inmunohistoquímicos o procedimientos para detectar un ácido nucleico de interés en una muestra de célula o tejido, existe una gran necesidad de mejoras adicionales. Dichas mejoras pueden relacionarse, por ejemplo, con una fijación más suave de una muestra de célula o tejido, con mejoras en la recuperación de antigeno y/o con una mejor comparabilidad y reproducibilidad de los resultados, y pueden ser incluso la posibilidad de usar anticuerpos para los que el correspondiente antígeno o epitopo se destruye en procedimientos estándares, como fijación con formaldehído.

Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que el uso de anhídridos bismaleicos como agente reticulante en la preparación/fijación de una muestra de célula o tejido es tremendamente ventajoso y puede conducir y conducirá a mejoras significativas referentes a al menos uno o incluso varios de los problemas conocidos en la materia.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la fijación de una muestra de célula o tejido in vitro, en el que dicha muestra de célula o tejido se incuba con un agente reticulante de anhídrido bismaleico, con lo que se fija dicha muestra de célula o tejido.

Se da a conocer adicionalmente un procedimiento de conservación de una muestra de célula o tejido, comprendiendo el procedimiento las etapas de fijación de una muestra de tejido con un agente reticulante de anhídrido bismaleico y de imbibición de dicha muestra fijada en parafina.

La presente invención da a conocer también un procedimiento para efectuar una inmunohistoquímica en una muestra de célula o tejido, comprendiendo el procedimiento las etapas de fijar una muestra de célula o tejido con un agente reticulante de anhídrido bismaleico, embeber dicha muestra fijada en parafina, desparafinar dicha muestra, retirar la reticulación de amida bismaleica y detectar inmunológicamente un epitopo de interés.

Se describe también un procedimiento para detectar in vitro un ácido nucleico de interés mediante hibridación in situ en una muestra de célula o tejido, comprendiendo el procedimiento las etapas de fijar una muestra de célula o tejido con un agente reticulante de anhídrido bismaleico, embeber dicha muestra fijada en parafina, desparafinar dicha muestra, retirar la reticulación de amida bismaleica y detectar un ácido nucleico de interés mediante hibridación in situ.

Adicionalmente, se da un procedimiento para detectar in vitro un ácido nucleico de interés mediante PCR-TR en una muestra de célula o tejido, comprendiendo el procedimiento las etapas de fijar una muestra de célula o tejido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la fijación de una muestra de célula o tejido in vitro en el que dicha muestra de célula o tejido se incuba con un anhídrido blsmalelco según la fórmula I

Fórmula I

X

en la que R1 y R2 se seleccionan Independientemente del grupo consistente en hidrógeno, metilo, etilo, propilo, ¡sopropllo y butilo,

en la que X es un ligador de entre 1 y 3 átomos de longitud con el que se fija dicha muestra de célula o tejido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que, en el anhídrido blsmaleico, R1 es hidrógeno o metilo y R2 es hidrogeno o metilo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que, en el anhídrido bismalelco, R1 y R2 son ¡guales.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 3, en el que, en el anhídrido bismaleico, el ligador X es de 1 a 2

átomos de longitud.

5. El anhídrido bismaleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el esqueleto del ligador X

consiste en átomos de carbono y opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados de O, N y S.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra se incuba con el

anhídrido bismaleico durante 1 a 72 horas.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo adicionalmente el procedimiento la etapa de embeber la muestra fijada en parafina.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo adicionalmente el procedimiento las etapas de

a) embeber la muestra fijada en parafina,

b) desparafinar dicha muestra,

c) retirar la reticulación de amida bismaleica y

d) detectar inmunológicamente un epítopo de interés.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo adicionalmente el procedimiento las etapas de

a) embeber la muestra fijada de la etapa (a) en parafina,

b) desparafinar dicha muestra,

c) retirar la reticulación de amida bismaleica y

d) detectar un ácido nucleico de interés mediante hibridación in situ.

1. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo adicionalmente el procedimiento las etapas de

a) embeber la muestra fijada en parafina,

b) desparafinar dicha muestra,

c) retirar la reticulación de amida bismaleica y

d) detectar un ácido nucleico de interés efectuando una PCR-RT.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo adicionalmente el procedimiento las etapas de

a) embeber la muestra fijada en parafina,

b) desparafinar dicha muestra,

c) retirar la reticulación de amida bismaleica y

d) detectar inmunológicamente el al menos un polipéptido de interés y detectar el al menos un ácido nucleico de interés efectuando una PCR-RT o hibridación fluorescente in situ.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo adicionalmente el procedimiento las etapas