Uso de derivados de fenantridio para diferenciar entre células intactas y con membrana comprometida usando técnicas moleculares a base de ácido nucleico.

Un método para diferenciar las células muertas de las células vivas que comprende exponer una mezcla de células vivas y muertas a monoazida de propidio (PMA).

Uso de derivados de fenantridio para diferenciar entre células intactas y con membrana comprometida usando técnicas moleculares a base de ácido nucleico 5

Antecedentes

La diferenciación de las células vivas y muertas es un reto importante en el diagnóstico microbiano. La actividad metabólica y reproductiva y, en el caso de los microorganismos patógenos, el potencial riesgo para la salud, están limitados a la parte viva de una población microbiana mixta. Mediante citometría de flujo usando tinciones fluorescentes se diferencian cuatro estados fisiológicos: células reproductivamente viables, metabólicamente activa, intactas y permeabilizadas. Dependiendo de las condiciones, todas las etapas, excepto las células permeabilizadas, pueden tener el potencial de recuperación tras reanimación y, por lo tanto, tienen que considerarse potencialmente vivas8. Debido a la persistencia relativamente larga del ADN después de la muerte celular en el intervalo de días a 3

semanas4.6, los diagnósticos basados en el ADN tienden a sobrestimar el número de células vivas. El ADN extraído de una muestra se puede originarse a partir de células en cualquiera de los cuatro estados fisiológicos mencionados, incluyendo las células permeabilizadas muertas. Sin embargo, no se desea detectar este último.

El criterio más importante para diferenciar entre células viables e irreversiblemente dañadas es la integridad de la membrana. La clasificación del ruido derivado de las células con la membrana comprometido ayuda a asignar actividades metabólicas y los riesgos para la salud de la parte intacta y viable de las comunidades bacterianas. Las células vivas con membranas intactas se diferencian por su capacidad para excluir colorantes que se unen al ADN de los que penetran fácilmente en las células muertas o con la membrana comprometida. Este principio se aplica de forma rutinaria a la discriminación microscopia de células muertas-vivas y cada vez más en la citometría de flujo. El colorante impermeable a la membrana más frecuente es el yoduro de propidio.

En los últimos años, se ha informado que la EMA-PCR es una alternativa fácil de usar para diferenciar, al microscopio o con citometría de flujo, entre células vivas y muertas11, 13, 14. Este método de diagnóstico, basado en el ADN, combina el uso de un colorante de discriminación de vivos-muertos con la velocidad y la sensibilidad de la PCR en tiempo real. La monoazida de etidio (EMA) es un colorante de intercalación en el ADN con el grupo azida que permite la unión covalente de la sustancia química al ADN tras la exposición a luz visible brillante (máximo de absorbancia a 460 nm) . Las células se expusieron a EMA durante 5 minutos de modo que se permitió que el colorante penetrara en las células muertas con paredes/membranas celulares comprometidas y que se uniera a su ADN. La fotólisis de EMA usando luz visible brillante produce un nitreno que puede formar un enlace covalente con 35 el ADN y otras moléculas1, 2. Se ha notificado que la reticulación inducida inhibía la amplificación por PCR del ADN de las células muertas. En una publicación reciente se pudo demostrar que la reticulación por EMA del ADN en realidad hizo que el ADN fuera insoluble y llevó a su pérdida, junto con restos de células durante la extracción de ADN genómico10. La EMA no unida, que permanece libre en solución, se inactiva simultáneamente mediante la reacción con moléculas de agua2. La hidroxilamina resultante ya no es capaz de unirse covalentemente al ADN3. El ADN de células viables, protegido de EMA reactiva antes de la exposición a la luz por una pared/membrana celular intacta, por lo tanto no está afectado por la EMA inactivado después de la lisis celular. El tratamiento con EMA de cultivos bacterianos comprendidos por una mezcla de células viables y muertas conduce a la extracción selectiva de ADN de las células muertas. Las especies analizadas fueron E. coli 0157:H711, Salmonella typhimurium11 , Listeria monocytogenes11, 13, 14 y Campyloboacter jejuni13 . Sin embargo, estos estudios no investigaron la pérdida selectiva de 45 ADN a partir de células muertas.

Aunque esta técnica es prometedora, se encontró que el uso de EMA antes de la extracción de ADN presentaba un inconveniente importante. En el caso de E. coli 0157:H7, aunque se eliminó todo el ADN genómico de las células muertas, el tratamiento también tuvo como resultado la pérdida de aproximadamente el 60 % del ADN genómico de las células viables recolectadas en la fase log10. En este estudio se observó que la EMA también penetra fácilmente en las células viables de otras especies bacterianas, lo que tiene como resultado la pérdida parcial de ADN. La falta de selectividad y de la aplicabilidad general llevó a probar un producto químico alternativo recién desarrollado: monoazida de propidio (PMA) . La PMA es idéntica a la PI excepto porque la presencia adicional de un grupo azida permite la reticulación con el ADN tras la exposición a la luz. Dado que el PI es altamente impermeable a la 55 membrana y generalmente excluido de células viables, se ha utilizado ampliamente para identificar las células muertas en las poblaciones mixtas. Al atravesar las membranas celulares comprometidas, el PI se une al ADN por intercalación entre las bases con poca o ninguna secuencia de preferencia y con una estequiometría de una molécula de colorante por 4-5 pares de bases de ADN.17

El documento WO01/77379 describe métodos basados en PCR para diferenciar células vivas y muertas, en los que se utilizan sondas de viabilidad, tales como monoazida de etidio, para modificar ácido nucleico en las células muertas, de forma que se inhibe de manera selectiva la amplificación de ácido nucleico a partir de las células muertas.

La mayor carga de la molécula de PMA (2 cargas positivas en comparación con sólo una en el caso de EMA) y el hecho de que la tinción selectiva de las células no viables con yoduro de propidio (PI) se ha realizado con éxito en

una amplia variedad de tipos de células, dio confianza de que el uso de PMA podría mitigar los inconvenientes observados con EMA.

La invención examinó la idoneidad de PMA para eliminar selectivamente la detección del ADN genómico de las células muertas de cultivos bacterianos con porciones definidas de células vivas y muertas. Debido a que esta es una molécula de nuevo desarrollo, la optimización de los métodos era necesaria. El tiempo de exposición a la luz para la unión al ADN y la inactivación simultánea de la PMA libre no unida se optimizó mediante el uso de ADN purificado. La concentración de PMA y el tiempo de incubación se optimizaron con un organismo gramnegativo y uno grampositivo antes de aplicar estos parámetros al estudio de un amplio espectro de diferentes especies bacterianas.

Sumario de la invención

La invención comprende un método para limitar el diagnóstico molecular a la parte de una comunidad microbiana con las membranas celulares intactas. Esto se consigue mediante la exposición de una mezcla de células intactas y de membrana comprometida a PMA. En una forma de realización, dicho PMA es fenantridio, dicloruro de 3-amino-8azido-5-[3- (dietilmetilamonio) propil]-6-fenilo. En otra forma de realización, dicho método comprende aislar el ADN genómico a partir de dicha mezcla. En otra forma de realización, en la que se realiza la PCR utilizando ADN genómico a partir de la mezcla como un molde.

La invención también comprende un método de analizar la eficacia del tratamiento con un desinfectante y/o antibiótico, exponer un cultivo de células a un candidato desinfectante y/o antibiótico; exponer adicionalmente dicho cultivo celular a PMA; exponer dicha muestra que contiene PMA -a una fuente de luz; aislar ADN genómico de dicha muestra; y realizar la PCR en dicho ADN aislado, a continuación, comparar los resultados de la PCR entre dichos cultivos tratados desinfectantes con cultivos no tratados.

En una forma de realización, el cultivo comprende un organismo del grupo que consiste en Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, E. coli y Mycobacterium avium. En otra forma de realización, dicha mezcla de células comprende más de un organismo. En otra forma de realización, dicho método se puede aplicar a una amplia gama de especies bacterianas y cualquier otra célula en la que la perforación de la membrana celular permite la captación del colorante intercalante de ácido nucleico.

La invención también comprende un método de analizar un desinfectante y/o antibiótico que comprende exponer un cultivo de células a un candidato desinfectante y/o antibiótico; exponer adicionalmente dicho cultivo celular a PMA;

exponer dicho cultivo celular que... [Seguir leyendo]

1. Un método para diferenciar las células muertas de las células vivas que comprende exponer una mezcla de células vivas y muertas a monoazida de propidio (PMA) . 5

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende aislar ADN genómico de dicha mezcla.

3. El método de la reivindicación 1, en el que en dicha mezcla se realiza una PCR.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende aislar ARN de dicha mezcla.

5. El método de la reivindicación 3, en el que en dicho ARN aislado se realiza una RT-PCR.

6. Un método de analizar un desinfectante y/o un antibiótico, que comprende 15

a. exponer un cultivo celular a un candidato desinfectante y/o antibiótico;

b. exponer adicionalmente dicho cultivo celular a PMA;

c. exponer dicha muestra que contiene PMA a una fuente de luz;

d. aislar el ADN genómico de dicha muestra; y

e. realizar una PCR sobre dicho ADN aislado;

a continuación, comparar los resultados de la PCR entre dichos cultivos tratados con desinfectante y los cultivos no tratados.

7. Un método de analizar un desinfectante y/o un antibiótico, que comprende

a. exponer un cultivo celular a un desinfectante y/o un antibiótico candidatos;

b. exponer adicionalmente dicho cultivo celular a PMA;

c. exponer dicho cultivo celular que contiene PMA a una fuente de luz;

d. aislar el ARN del cultivo celular; y

e. realizar RT-PC en ARN aislado;

a continuación, comparar los resultados de la RT-PCR entre dichos cultivos tratados con desinfectante y los cultivos no tratados.

8. El método de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en donde dicho cultivo comprende un organismo del grupo que consiste en Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, E. coli y Mycobacterium avium.

9. El método de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en el que dicho cultivo celular comprende más de un organismo bacteriano.

10. El método de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en el que dichos desinfectante y/o antibiótico rompen la integridad de la membrana.

11. Un método de perfilado microbiano de una muestra, que comprende

a. recoger una muestra;

b. exponer dicha muestra a PMA;

c. exponer dicha muestra que contiene PMA a una fuente de luz;

d. aislar el ADN genómico de dicha muestra; y

e. realizar la PCR sobre dicho ADN aislado;

12. Un método de perfilado microbiano de una muestra, que comprende 55 a. recoger una muestra;

b. exponer dicha muestra a PMA;

c. exponer dicha muestra que contiene PMA a una fuente de luz;

d. aislar el ARN de dicha muestra; y

e. realizar RT-PC en dicho ARN aislado.

13. El método de la reivindicación 11 o de la reivindicación 12, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en suelo, agua, aguas residuales, alimentos, productos agrícolas, productos farmacéuticos y cosméticos.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores el que dicho PMA es dicloruro de 3-amino-8

azido-5- (3-dietilmetilamonio) propil) -6-fenilfenantridio, dibromuro de 3-amino-8-azido-5- (3- (dietilmetilamonio) propil) -6fenilfenantridio o dibromuro de 3-amino-8-azido-5- (3- (dietilmetilamonio) propil) -6-fenilfenantridio.