Terapia de combinación para trastornos de células B.

Un método para agotar células B de una población mixta de células in vitro,

que comprende poner en contacto la población mixta de células con un antagonista de BLyS y un anticuerpo de unión a CD20, en el que el antagonista de BLyS se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-BLyS, en donde el anticuerpo anti-BLyS bloquea parcial o completamente la interacción de BR3 con un polipéptido de BLyS; un anticuerpo anti-BR3; una inmunoadhesina de BR3; o un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 10.

Terapia de combinación para trastornos de células B

Campo de la invención La invención se refiere a nuevas terapias de combinación para el tratamiento de tumores malignos de células B así como trastornos autoinmunitarios Antecedentes de la invención Los linfocitos son una de varias poblaciones de glóbulos blancos; reconocen específicamente y responden a antígeno ajeno. Las tres clases principales de linfocitos son linfocitos B (células B) , linfocitos T (células T) y células citolíticas naturales (NK) . Los linfocitos B son las células responsables de la producción de anticuerpos y proporcionan inmunidad humoral. Los linfocitos B maduran dentro de la médula ósea y dejan la médula expresando un anticuerpo de unión a antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B virgen se encuentra por primera vez con el antígeno para el que su anticuerpo unido a membrana es específico, la célula comienza a dividirse rápidamente y su descendencia se diferencia en células B de memoria y células efectoras denominadas "células plasmáticas". Las células B de memoria tienen una esperanza de vida más larga y continúan expresando un anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula parental original. Las células plasmáticas no producen anticuerpos unido a membrana sino que producen en su lugar una forma secretada del anticuerpo. Los anticuerpos secretados son las moléculas efectoras principales de la inmunidad humoral.

El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humano, Bp35) es una proteína transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD localizada en linfocitos pre-B y B maduros (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989) ; y Einfeld et al. EMBO J. 7 (3) : 711-717 (1988) ) . El antígeno también se expresa en más del 90 % de linfomas no de Hodgkin (NHL) de células B (Anderson et al. Blood 63 (6) : 1424-1433 (1984) ) , pero no se encuentra en células madre hematopoyéticas, células pro-B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder et al. J. Immunol. 135 (2) : 973-979 (1985) ) . Se cree que CD20 regula una etapa o etapas tempranas en el proceso de activación para el inicio y diferenciación del ciclo celular (Tedder et al., mencionado anteriormente) y posiblemente actúe como un canal de ión de calcio (Tedder et al.

J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990) ) .

Dada la expresión de CD20 en linfomas de células B, este antígeno ha sido una diana terapéutica útil para tratar dichos linfomas. Hay más de 300.000 personas en los Estados Unidos con NHL de células B y se diagnostican cada año más de 56.000 nuevos casos. Por ejemplo, el anticuerpo rituximab (RITUXAN®) que es un anticuerpo monoclonal humano/murino quimérico modificado por ingeniería genética dirigido contra el antígeno CD20 humano (disponible en el mercado de Genentech, Inc., South San Francisco, California, Estados Unidos) se usa para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin de células B, CD20 positivo, recidivante o refractario de grado bajo o folicular. Rituximab es el anticuerpo denominado "C2B8" en la Patente de Estados Unidos Nº 5.736.137 presentada el 7 de abril de 1998 (Anderson et al.) . El mecanismo in vitro de estudios de acción ha demostrado que RITUXAN® se une con el complemento humano y lisa líneas celulares B linfoides mediante citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83 (2) : 435-445 (1994) ) . Adicionalmente, tiene actividad significativa en ensayos para citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Los estudios preclínicos in vivo ha mostrado que RITUXAN® agota las células B de la sangre periférica, ganglios linfáticos y médula ósea de monos cynomolgus, supuestamente mediante procesos mediados por célula y complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83 (2) : 435-445 (1994) ) . Otros anticuerpos anti-CD20 indicados para el tratamiento de NHL incluyen el anticuerpo murino Zevalin que se une con el radioisótopo. El Itrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) , BexxarTM que es otro anticuerpo completamente murino conjugado con I-131 (Corixa, WA) .

BLyS (también conocido como BAFF, TALL-1, THANK, TNFSF13B o zTNF4) es un miembro de la superfamilia del ligando TNF1 que es esencial para la supervivencia y maduración de las células B. La sobreexpresión de BLyS en ratones transgénicos conduce a hiperplasia de células B y desarrollo de enfermedad autoinmunitaria grave (Mackay, et al. (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710; Gross, et al. (2000) Nature 404, 995-999; Khare, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3370-33752-4) . Los niveles de BLyS están elevados en pacientes humanos con diversos trastornos autoinmunitarios, tales como lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y síndrome de Sjögren (Cheema, G. S, et al., (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319; Groom, J., et al, (2002) J. Clin. Invest. 109, 59-68; Zhang, J., et al., (2001) J. Immunol. 166, 6-10) . Además, los niveles de BLyS se correlacionan con la gravedad de la enfermedad, lo que sugiere que BLyS puede desempeñar un papel directo en la patogénesis de estas enfermedades. BLyS actúa en las células B uniéndose con tres miembros de la superfamilia del receptor de TNF, TACI, BCMA y BR3 (también conocido como BAFF-R) (Gross, et al., mencionado anteriormente; 8. Thompson, J. S., et al., (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., et al., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552; Yan, M., et al., (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41; Schiemann, B., et al., (2001) Science 293, 2111-2114) . De los tres, solamente BR3 es específico para BLyS; los otros dos también se unen con el miembro de la familia de TNF relacionado, APRIL. La comparación de los fenotipos de BLyS y ratones con anulación del receptor o mutantes indica que la señalización a través de BR3 media en las funciones de supervivencia de células B de BLyS (Thompson, et al., mencionado anteriormente; Yan,

(2002) , mencionado anteriormente; Schiemann, mencionado anteriormente) . Por el contrario, TACI parece actuar como un receptor inhibidor (Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643) , mientras que el papel de BCMA no está claro (Schiemann, mencionado anteriormente) .

BR3 es una proteína transmembrana de tipo III de 184 restos expresada en la superficie de células B (Thompson, et al., mencionado anteriormente; Yan, (2002) , mencionado anteriormente) . La región intracelular no porta ninguna similitud de secuencia con dominios estructurales conocidos o motivos de interacción proteína-proteína. No obstante, la señalización inducida por BLyS a través de BR3 da como resultado el procesamiento del factor de transcripción NF-B2/p100 a p52 (Claudio, E, et al., (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965; Kayagaki, N., et al., (2002) Immunity 10, 515-524) . El dominio extracelular (ECD) de BR3 también es divergente. Los miembros de la familia de TNFR se caracterizan habitualmente por la presencia de múltiples dominios ricos en cisteína (CRD) en su región extracelular; cada CRD está compuesto normalmente de ~40 restos estabilizados por seis cisteínas en tres enlaces disulfuro. Los miembros convencionales de esta familia realizan contactos con el ligando a través de dos CRD que interaccionan con dos zonas distintas en la superficie del ligando (revisado en Bodmer, J. L., et al., (2002) Trends Biochem. Sci. 27, 19-26) . Sin embargo, el ECD de BR3 contiene solamente cuatro restos de cisteína, capaces de formar un CRD parcial como máximo, planteando la cuestión de cómo un receptor tan pequeño transmite unión de ligando de alta afinidad.

Previamente se ha mostrado que el dominio de unión de BLyS de BR3 reside dentro una región central de 26 restos (Kayagaki, et al., mencionado anteriormente) . Seis restos de BR3, cuando se estructuran dentro un péptido en horquilla ß (bhpBR3) , fueron suficientes para conferir unión a BLyS y bloquear la señalización mediada por BR3. Otros han presentado polipéptidos que se ha propuesto que interaccionan con BLyS (por ejemplo, documentos WO 02/24909, WO 03/035846, WO 02/16312, WO02/02641) .

Sumario de la invención La invención proporciona un método para agotar células B de una población mixta de células de acuerdo con la reivindicación 1. Este método es útil por ejemplo, en un ensayo in vitro comercial para agotar eficaz y selectivamente células B de una población mixta de células, poniendo en contacto las células B con un antagonista de BLyS y un anticuerpo anti-CD20. Otra realización del método precedente de agotamiento de células B es agotar específicamente ciertos subconjuntos de células B tales como células B de un centro germinal y células B de zona marginal. Las células B de centro germinal desveladas en el presente documento pueden estar en el bazo... [Seguir leyendo]

1. Un método para agotar células B de una población mixta de células in vitro, que comprende poner en contacto la población mixta de células con un antagonista de BLyS y un anticuerpo de unión a CD20, en el que el antagonista de BLyS se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-BLyS, en donde el anticuerpo anti-BLyS bloquea parcial o completamente la interacción de BR3 con un polipéptido de BLyS; un anticuerpo anti-BR3; una inmunoadhesina de BR3; o un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 10.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células B para agotamiento son células B de zona marginal o células B de centro germinal.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el antagonista de BLyS es una inmunoadhesina de BR3.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la inmunoadhesina de BR3 es hBR3-Fc de SEC ID Nº: 2.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el antagonista de BLyS es un anticuerpo anti-BLyS.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el antagonista de BLyS es un anticuerpo anti-BR3.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de unión a CD20 es rituximab.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de unión a CD20 es un anticuerpo humanizado.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de unión a CD20 es un anticuerpo humanizado que es hu2H7v.16 que tiene la secuencia de cadena ligera y cadena pesada de SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

10. El método de la reivindicación 1, en el que el antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 producen un efecto sinérgico para agotar las células B.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de unión a CD20 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD20 humanos, ibritumomab tiuxetan, yodo 1131 tositumomab, tositumomab/yodo 1131 tositumomab, m2H7, hu2H7, Tositumomab, 1 F5, ch2H7, AME-133, A20, A20 quimérico, A20 humanizado, L27, G28-2.

9. 1 B3, B-C1 y NU-B2.

12. Un antagonista de BLyS y un anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso en un método para agotar células B de una población mixta de células, en donde el antagonista de BLyS se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-BLyS, en donde el anticuerpo anti-BLyS bloquea parcial o completamente la interacción de BR3 con un polipéptido de BLyS; un anticuerpo anti-BR3; una inmunoadhesina de BR3; o un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 10; y en donde el método comprende administrar el antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación a un mamífero que lo necesite.

13. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde las células B para agotamiento son células B de zona marginal o células B de centro germinal.

14. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de unión a CD20 y el antagonista de BLyS son para administración simultánea.

15. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de unión a CD20 y el antagonista de BLyS con para administración secuencial.

16. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antagonista de BLyS es para administración antes del anticuerpo de unión a CD20.

17. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antagonista de BLyS es una inmunoadhesina de BR3.

18. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la inmunoadhesina de BR3 es hBR3-Fc de SEC ID Nº: 2.

19. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la

reivindicación 12, en donde el antagonista de BLyS es un anticuerpo anti-BLyS.

20. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antagonista de BLyS es un anticuerpo anti-BR3. 5

21. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de unión a CD20 es un anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables de un anticuerpo murino fusionado con las regiones constantes de un anticuerpo humano.

22. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el anticuerpo quimérico es rituximab.

23. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de unión a CD20 es un anticuerpo humanizado. 15

24. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo de unión a CD20 es un anticuerpo humanizado que es hu2H7v.16 que tiene la secuencia de cadena ligera y cadena pesada de SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, respectivamente.

25. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antagonista de BLys el anticuerpo de unión a CD20 producen un afecto sinérgico para agotar las células B.

26. El antagonista de BLyS y el anticuerpo de unión a CD20 en combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo anti-CD20 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD20 humanos, ibritumomab tiuxetan, yodo 1131 tositumomab, tositumomab/yodo 1131 tositumomab, m2H7, hu2H7, Tositumomab, 1 F5, ch2H7, AME-133, A20, A20 quimérico, A20 humanizado, L27, G28-2.

9. 1 B3, B-C1 y NU-B2.