Terapéutica con ARNi multidirigidos para la cicatrización de heridas de la piel sin cicatriz.

Una composición que comprende al menos tres moléculas de ARNip diferentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable,

en la que al menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen TGF-β1, al menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen Cox-2 y por lo menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen Hoxb13, en la que dichas moléculas de ARNip diferentes inhiben la expresión de dichos genes tanto en células humanas como de ratón, en donde dicha composición comprende una nanopartícula que comprende un copolímero de histidina-lisina y en donde dichas moléculas de ARNip diferentes comprenden los siguientes oligonucleótidos:

(1) hmTF-2: sentido, 5'-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3' (SEC ID Nº 11) antisentido, 5'AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3' (SEC ID Nº 12);

(2) hmCX-1: sentido, 5'-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3' (SEC ID Nº 9) antisentido, 5'-ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3' (SEC ID Nº 10); y

(3) hmHX-1: sentido, 5'-GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3' (SEC ID Nº 7) antisentido, 5'- AACACAUCUGGCUGUUCCAGCCACC-3' (SEC ID Nº 8).

de ia invención

La presente invención se refiere a composiciones que contienen moléculas de ARNip y composiciones para su uso, que están dirigidas a la estimulación de la cicatrización de heridas en la piel, tal como se establece en las reivindicaciones.

La invención hace uso de una molécula pequeña de ARN de interferencia (ARNip) que comprende un oligonucleótido bicatenario (dúplex), en el que el oligonucleótido está dirigido a una secuencia de nucleótidos complementaria en una molécula de ARN monocatenario (ss) diana tal como se establece en las reivindicaciones. La molécula de ARNm diana codifica un gen seleccionado del HOXB13, TGF-p1, y COX-2. Las secuencias de ARNip se preparan de tal manera que cada dúplex pueda dirigirse a e inhibir el mismo gen a partir de, al menos, seres humanos y ratón o primates no humanos. Las moléculas de ARNip se construyen con referencia a las secuencias de codificación de ARNm diana enumeradas en las Tablas 2, 4 y 5.

En una realización, la molécula de ARNip tiene una longitud de 19-27 pares de bases. La molécula puede tener extremos romos en ambos extremos o extremos cohesivos en ambos extremos, o uno de cada. La molécula de ARNip puede incluir una modificación química a nivel de nucleótidos individuales o a nivel de la estructura básica del oligonucleótido, o puede no tener ninguna modificación.

Las moléculas se añaden a un vehículo farmacéuticamente aceptable para proporcionar composiciones para su administración a un sujeto. Preferentemente, el sujeto es un ser humano.

La composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos tres moléculas de ARNIp, como se establece en las reivindicaciones. Cada cóctel de ARNip contiene al menos tres dúplex de ARNIp dirigidos a por lo menos tres diferentes secuencias génicas tal como se establece en las reivindicaciones. Una composición que es una mezcla de moléculas de ARNip puede denominarse un "cóctel".

Una mezcla de cóctel se elige a partir de una mezcla que figura en la Tabla A. Una forma de realización particular se divulga en la Tabla A, en la que un ARNip (sentido: 5'-caaggauaucgaaggcuugcuggga -3', antisentido: 5'- ucccagcaagccuucgauauccuug-3') se une a las moléculas de ARNm que codifican la proteina HOXB13, de ser humano y de ratón, una molécula de ARNip (sentido: 5'- gucuuuggucuggugccuggucuga -3', antisentido: 5'- ucagaccaggcaccagaccaaagac-3') se une a las moléculas de ARNm que codifican la proteina COX-2, de ser humano y de ratón, una molécula de ARNip (sentido: 5'- ccccggaggugauuuccaucuacaa - 3', antisentido: 5'- uuguagauggaaaucaccuccgggg-3') se une a las moléculas de ARNm que codifican TGF-[31 de ser humano y de ratón. En otras formas de realización particulares divulgadas en la Tabla A, un ARNip (sentido: 5'- GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3', antisentido: 5'-AACACAUCUGGCUGUUCCAGCCACC-3') se dirige a una molécula de ARNm que codifica la proteina Hoxbl3 de ser humano y de ratón, al menos una molécula de ARNip (sentido: 5'-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3', antisentldo: 5'- ACAUCAUCAGACCAGGC ACCAGACC-3') se dirige a una molécula de ARNm que codifica la proteina Cox-2 de ser humano y de ratón, y al menos una molécula de ARNip (sentido: 5'-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3', antisentido: 5'-

AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3') se dirige a una molécula de ARNm que codifica TGF-[31 de ser humano y de ratón.

En todavía otras realizaciones, el cóctel de ARNip contiene al menos tres dúplex de ARNip en una proporción de 1: 1: 1, o 1: 1,5: 0,5 o una proporción de 0,5: 0,5: 2, u otras proporciones de acuerdo con la potencia de cada dúplex de ARNip y los requisitos terapéuticos para la aplicación.

La Invención proporciona además vehículos farmacéuticamente eficaces para mejorar la liberación del cóctel de ARNip en los tejidos y las células enfermos tal como se establece en las reivindicaciones.

En diversas realizaciones de la composición, el vehículo puede comprender uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en una solución salina, una solución de azúcar, un polímero, un lípido, una crema, un gel y un material mlcelar. Otros componentes o excipientes incluyen un agente aglutinante policatiónico, lípido catiónico, micela catiónica, polipéptldo catiónico, polímero injertado con polímero hidrófilo, polímero catiónico no natural, pollacetal catiónico, poliacetal injertado con polímero hidrófilo,, polímero catiónico funcionalizado con ligando y polímero injertado con polímero hidrófilo funcionalizado con ligando, poliésteres biodegradables, tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), y poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), PEG-PEI (polietilenglicol y polietilenimina), poli-espermina (espermidina) y dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM). El vehículo es un copolímero de histidina - lisina que se cree que forma una nanopartícula que contiene una molécula de ARNip, en el que la nanopartícula tiene un tamaño de aproximadamente 100 -400 mn de diámetro formulada con gel de metilcelulosa para la administración tópica.

Las moléculas de ARNip pueden identificarse mediante las etapas siguientes: 1) crear una colección de dúplex de ARNip diseñados para apuntar a una secuencia de nucleótidos complementaria en la molécula diana de ARN ss, en la que las hebras diana de dichas moléculas de ARNip comprenden varias secuencias de nucleótidos; 2) seleccionar las moléculas de ARNip que muestran el mayor efecto deseado contra dichas moléculas diana /n v/fro; 3) evaluar las moléculas ARNip seleccionadas en un modelo animal de la herida; y 4) seleccionar las moléculas de ARNip que muestran la mayor eficacia en el modelo. Un vehículo farmacéuticamente aceptable se puede añadir a cada una de las moléculas de ARNip seleccionadas mediante la etapa (2) para formar composiciones farmacéuticas, cada una de los cuales se evalúa en el modelo de herida animal. Preferentemente, el modelo de herida animal es un modelo de herida en el labio por escisión en un ratón defectivo para Hoxb13 o un modelo de herida por escisión en la espalda en un ratón defectivo para Hoxb13. Más preferentemente, las moléculas de ARNip se evalúan en ambos modelos animales. Dado que los genes diana pueden expresarse en diferentes tipos de células en los tejidos enfermos, la eficacia del cóctel de ARNip particular se analiza y se confirma no solo en el cultivo celular, sino también en modelos de enfermedad animal. Preferentemente, se seleccionan los componentes del cóctel de ARNip de modo que el beneficio terapéutico del cóctel es mejor que el beneficio terapéutico de un solo componente ARNip por sí mismo.

También se proporcionan métodos para preparar la proporción adecuada de cada dúplex a fin de permitir que el cóctel de ARNip logre el efecto sinèrgico más potente. En una realización, la proporción se determina mediante la determinación del nivel de expresión de la secuencia diana en comparación con la de la secuencia de control. Una secuencia diana de mayor expresión requerirá una mayor proporción de las correspondientes moléculas de ARNip.

La invención también proporciona la composición de la invención para el tratamiento de una herida dérmica o epidérmica en un sujeto. La herida puede estar causada por una lesión física, una quemadura, una alergia, enfermedad diabética, inflamación o un tumor. La herida puede caracterizarse al menos en parte por inflamación y neovascularización. La composición se puede aplicar en un ungüento, aerosol, parche transdérmico u otras formas conocidas por los expertos en la técnica.

La terapia mediada por ARNip con éxito no solo depende de la identificación de las dianas y la secuencia de las moléculas de ARNip activas, sino también de la liberación /n v/vo eficiente en los tejidos diana y en el citoplasma (41-43). Las vías de liberación de la formulación en cóctel de ARNip para el tratamiento de heridas en la piel, la cicatrización debe ser local y tópica con vehículos validados clínicamente adecuados según lo establecido en las reivindicaciones. Además de usar imiquimod en crema al 5% como vehículo para la aplicación tópica del cóctel de ARNip, tres vehículos basados en polímeros, incluyendo polímeros de histidina - Usina (HKP) (44), PEI pegilado (45) y dendrímero PAMAM (46) son vehículos particularmente útiles.

Ejempios

Ejempio 1. Modeio de cirugía de ¡abios para anáiisis de cicatrización de heridas

Hay resultados de estudios anteriores que muestran que heridas cutáneas en la piel de ratones KO en HOXB13 cicatrizaron con una cicatrización reducida. Las posibles diferencias entre la piel de la espalda y del labio plantearon la cuestión de si la herida en los labios en ratones defectivos cicatrizaría... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende al menos tres moléculas de ARNip diferentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que al menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada 5 por un gen TGF-)31, al menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen Cox-2 y por lo menos una de dichas moléculas de ARNip está dirigida a una molécula de ARNm codificada por un gen Hoxb13, en la que dichas moléculas de ARNip diferentes inhiben la expresión de dichos genes tanto en células humanas como de ratón, en donde dicha composición comprende una nanopartícula que comprende un copolímero de histidina-lisina y en donde dichas moléculas de ARNip diferentes comprenden los 10 siguientes oligonucleótidos:

(1) hmTF-2: sentido, 5'-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3' 5'AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG-3' (SEC ID N^ 12);

(2) hmCX-1: sentido, 5'-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3' ACAUCAUCAGACCAGGCACCAGACC-3' (SEC ID N^ 10); y

(3) hmHX-1: sentido, 5'-GGUGGCUGGAACAGCCAGAUGUGUU-3' AACACAUCUGGCUGUUCCAGCCACC-3' (SEC ID N^ 8).

(SEC ID N- 11) antisentido,

(SEC ID N- 9) antlsentldo, 5'-

(SEC ID N- 7) antlsentldo, 5'-

2. La composición de la reivindicación 1 para su uso en medicina.

3. La composición de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una herida dérmica o epidérmica en un mamífero, en dondedlcha herida se caracteriza, al menos en parte, por Inflamación y neovascularlzaclón.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho mamífero es un ser humano.

5. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde el uso de dicha composición da como resultado la cicatrización de heridas con formación de cicatrices reducida.