Sustancias que inhiben la glucólisis en cultivo celular.

Un medio de cultivo celular que comprende 2-desoxiglucosa y glucosa,

en el que 2-desoxiglucosa está presente a entre 0,25 gramos por litro y 1 gramo por litro, en el que la relación entre 2-desoxiglucosa y glucosa es igual o menor que de 1 a 9, y,

en el que el medio está definido.

Sustancias que inhiben la glucólisis en cultivo celular Antecedentes de la invención Las proteínas y los polipéptidos se han convertido en agentes terapéuticos y comerciales cada vez más importantes. En la mayoría de los casos, estas proteínas y polipéptidos se producen en cultivo celular, a partir de células que se han diseñado y/o seleccionado para producir niveles inusualmente elevados de la proteína o polipéptido de interés particular. El control y la optimización de las condiciones de cultivo celular son críticamente importantes para el éxito de la producción de proteínas y polipéptidos Muchas proteínas y polipéptidos producidos en cultivo celular son fabricados en un proceso discontinuo o alimentado de forma discontinua, en el que las células se cultivan durante un período de tiempo y después el cultivo se termina y se aísla la proteína o polipéptido producido. Como alternativa, las proteínas o polipéptidos pueden producirse en un proceso de cultivo celular de perfusión en el que el cultivo no se termina y periódicamente se añaden nuevos nutrientes y otros componentes al cultivo y durante el mismo se cosechan periódicamente la proteína o polipéptido expresado. La cantidad y la calidad últimas de la proteína o polipéptido producido pueden verse afectadas espectacularmente por las condiciones del cultivo celular. Por ejemplo, los procesos de cultivo discontinuo o de alimentación discontinua tradicionales a menudo tienen como resultado la producción de productos de desecho metabólicos que tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento o la viabilidad celular, y sobre la producción o estabilidad de la proteína o polipéptido de interés. Entre estos productos de desecho perjudiciales está el metabolito lactato de la glucosa. La acumulación de lactato ha mostrado que reduce el pH del cultivo celular y es perjudicial tanto para la viabilidad como la productividad celular (véase Gorfien y col., Optimized Nutrient Additives for Fed-Batch Cultures, Biopharm. International, Abril 2003) . Aunque se han realizado diversos esfuerzos para mejorar la producción de proteínas y polipéptidos en procesos de cultivo celular, sigue habiendo la necesidad de mejoras adicionales.

Adicionalmente, se han invertido esfuerzos significativos en el desarrollo de medios definidos (es decir, medios formados por componentes individuales conocidos y que carecen de suero u otros subproductos animales) para su uso en el cultivo de células, particularmente de células de mamíferos. Las características de crecimiento de la célula pueden ser muy diferentes en medios definidos, en contraste con los medios derivados de suero. Existe la necesidad particular del desarrollo de sistemas mejorados para producir proteínas y polipéptidos mediante cultivo celular en medios definidos, en los que la acumulación de productos de desecho perjudiciales se reduce o elimina.

Sumario de la invención La presente invención proporciona procedimientos y composiciones mejorados de producción a gran escala de proteínas y/o polipéptidos en cultivo celular. En determinadas realizaciones, se proporciona un medio de cultivo celular que comprende 2-desoxiglucosa y glucosa, en el que la 2-desoxiglucosa está presente a entre 0, 25 gramos por litro y 1 gramo por litro, en el que la relación entre 2-desoxiglucosa y glucosa es igual o inferior a de 1 a 9, y, en el que el medio está definido. En determinadas realizaciones, se proporciona un medio de cultivo celular que contiene una sustancia inhibidora de la glucólisis, en el que la glutamina está presente an una concentración que es menor que aproximadamente 13 mM. En determinadas realizaciones se proporciona un medio de cultivo celular que contiene una sustancia inhibidora de la glucólisis, en el que la glutamina está presente an una concentración que es menor que aproximadamente 4 mM. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo celular de la presente invención se usan para cultivar células de mamífero que expresan una proteína o polipéptido de interés.

En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos de cultivo a escala comercial (por ejemplo, 500 l o más) que utilizan un medio que contiene 2-desoxiglucosa y glucosa, en el que la 2-desoxiglucosa está presente en entre 0, 25 gramos por litro y 1 gramo por litro, en el que la relación entre 2-desoxiglucosa y glucosa es igual o menor que de 1 a 9. En determinadas realizaciones, los procedimientos de cultivo como se ha divulgado pueden incluir uno o más cambios de temperatura durante el curso del cultivo celular. De acuerdo con las enseñanzas en el presente documento, el uso de tales procedimientos permite altos niveles de producción de proteínas y disminuye la acumulación de ciertos factores indeseables, incluido, aunque sin limitaciones, lactato.

Un experto en la técnica entenderá que las formulaciones de medios de la presente divulgación abarcan medios tanto definidos como complejos. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo es un medio definido en el que se conoce y se controla la composición del medio.

En determinadas realizaciones, las células se cultivan de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de cultivo celular descritos en la solicitud de patente de EE.UU. Nº de Serie. 11/213.308, 11/213.317 Y 11/213.633 cada una de las cuales se presentó el 25 de agosto de 2005. En algunas realizaciones, las células se cultivan en una o más de las condiciones descritas en la solicitud de patente provisional de EE.UU. Nº de Serie 60/830.658, presentada el 13 de julio de 2006.

Los cultivos celulares de la presente invención pueden suplementarse opcionalmente con nutrientes y/u otros componentes del medio, incluyendo, por ejemplo, hormonas y/o otros factores de crecimiento, iones (tales como

sodio, cloruro, calcio, magnesio, y/o fosfato) , tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, oligoelementos (compuestos inorgánicos presentes habitualmente a concentraciones finales muy bajas) , aminoácidos, lípidos y/o glucosa u otras fuentes de energía. En determinadas realizaciones, es beneficioso suplementar los medios con uno o más inductores químicos tales como hexametileno-bis (acetamida) ("HMBA") y butirato de sodio ("NaB") . Estos suplementos opcionales se pueden añadir al comienzo del cultivo o pueden añadirse en un momento posterior con el fin de reponer los nutrientes agotados o por otra razón. En general, es deseable seleccionar la composición del medio inicial para minimizar la suplementación de acuerdo con la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el crecimiento celular de células -GDF-8 en presencia de 2-desoxiglucosa en placas.

La figura 2 muestra el crecimiento celular de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2desoxiglucosa.

La figura 3 muestra la viabilidad de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2-desoxiglucosa.

La figura 4 muestra el título de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2-desoxiglucosa.

La figura 5 muestra la acumulación de lactato de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2desoxiglucosa.

La figura 6 muestra el crecimiento celular de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2desoxiglucosa.

La figura 7 muestra el título de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2-desoxiglucosa.

La figura 8 muestra la acumulación de lactato de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2desoxiglucosa.

La figura 9 muestra la captación de glucosa de células -GDF-8 en biorreactores de 1 l con y sin 2desoxiglucosa.

La Figura 10 muestra la densidad de células viables diarias de células -GDF-8 células en presencia y ausencia de 2-desoxiglucosa.

La Figura 11 muestra el título diario de células -GDF-8 células en presencia y ausencia de 2-desoxiglucosa.

La Figura 12 muestra los niveles diarios de lactato de células -GDF-8 células en presencia y ausencia de 2desoxiglucosa.

La Figura 13 muestra los niveles diarios de glucosa de células -GDF-8 células en presencia y ausencia de 2desoxiglucosa.

La Figura 14 muestra la productividad específica diaria de células -GDF-8 células en presencia y ausencia de 2-desoxiglucosa.

Definiciones "Aminoácido": El término "aminoácido" como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural que se usan normalmente en la formación de polipéptidos o análogos o derivados de dichos aminoácidos o cualquier aminoácido de origen no natural. Los aminoácidos de la presente invención se proporcionan en medio a cultivos celulares. Los aminoácidos proporcionados en el medio se pueden proporcionar como sales o en forma de hidrato.... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo celular que comprende 2-desoxiglucosa y glucosa, en el que 2-desoxiglucosa está presente a entre 0, 25 gramos por litro y 1 gramo por litro, en el que la 5 relación entre 2-desoxiglucosa y glucosa es igual o menor que de 1 a 9, y, en el que el medio está definido.

2. El medio de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente glutamina a menos de 13 mM.

3. El medio de la reivindicación 1, en el que el medio comprende adicionalmente glutamina presente a 8 g/l o más.

4. El medio de la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo celular tiene un medio característico seleccionado del

grupo que consiste en: (i) una concentración de aminoácido acumulada superior a 70 mM, (ii) un relación molar entre glutamina acumulada y asparagina acumulada de menos de 2, (iii) una relación molar entre la glutamina acumulada y los aminoácidos totales acumulados de menos de 0, 2, (iv) una relación molar entre los iones inorgánicos acumulados y los aminoácidos totales acumulados de entre 0, 4 y 1, (v) una concentración combinada de glutamina acumulada y asparagina acumulada entre 16 y 36 mM, y combinaciones de los mismos.

5. El medio de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente manganeso a una concentración entre 10 y 600 nM.

6. Un procedimiento de producción de un polipéptido en un medio de cultivo celular, que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica un polipéptido de interés, cuyo gen es expresadop en condiciones de cultivo celular, en un medio de cultivo celular que comprende 2-desoxiglucosa y glucosa, en el que hay 2-desoxiglucosa presente a entre 0, 25 gramos por litro y 1 gramo por litro, y en el que la relación entre 2-desoxiglucosa y glucosa es igual o menor que de 1 a 9; y mantener el cultivo en condiciones, y durante un tiempo suficiente, para permitir la expresión del polipéptido, de tal manera que los niveles de lactato del cultivo sean más bajos que los niveles de lactato producidos en condiciones de otro modo idénticas en un medio de otro modo idéntico que carece de 2-desoxiglucosa.

7. Un procedimiento de producción de un polipéptido en un medio de cultivo celular, que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica un polipéptido de interés, cuyo gen es expresado en condiciones de cultivo celular, en un medio de cultivo celular que comprende 2-desoxiglucosa y glucosa, en el que hay 2-desoxiglucosa presente entre 0, 25 gramos por litro y 1 gramo por litro, y en el que la relación entre 2-desoxiglucosa y glucosa es igual o menor que de 1 a 9;

mantener el cultivo a un primer intervalo de temperatura durante un primer periodo de tiempo;

cambiar el cultivo a un segundo intervalo de temperatura, en el que al menos una temperatura del segundo intervalo de temperatura es inferior a la temperatura más baja del primer intervalo de temperaturas; y mantener el cultivo durante un segundo periodo de tiempo en condiciones, y durante un tiempo suficiente, para permitir la expresión del polipéptido, en el que los niveles de lactato del cultivo sean más bajos que los niveles de lactato observados en condiciones de otro modo idénticas en un medio de otro modo idéntico que carece de 2-desoxiglucosa.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que el medio de cultivo celular comprende además glutamina a menos de 13 mM.

9. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que el medio de cultivo celular comprende además glucosa, y en 40 el que el nivel de glucosa se mantiene a 8 g/l o más.

10. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que el medio de cultivo celular tiene un medio característico seleccionado del grupo que consiste en: (i) una concentración de aminoácido acumulada superior a 70 mM, (ii) un relación molar entre glutamina acumulada y asparagina acumulada de menos de 2, (iii) una relación molar entre la glutamina acumulada y los aminoácidos totales acumulados de menos de 0, 2, (iv) una relación molar entre los iones 45 inorgánicos acumulados y los aminoácidos totales acumulados de entre 0, 4 y 1, (v) una concentración combinada de glutamina acumulada y asparagina acumulada entre 16 y 36 mM, y combinaciones de los mismos.

11. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que el medio de cultivo celular comprende además manganeso a una concentración entre 10 y 600 nM.

12. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que el cultivo celular es proporcionado además con 50 componentes suplementarios.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que los componentes suplementarios son proporcionados en un medio de alimentación.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que los componentes suplementarios comprenden 2desoxiglucosa.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que los componentes suplementarios son seleccionados del grupo que consiste en hormonas u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato) , tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, oligoelementos (compuestos inorgánicos presentes habitualmente a concentraciones finales muy bajas) , aminoácidos, lípidos y/o glucosa u otra fuente de energía, y combinaciones de los mismos.

16. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el primer intervalo de temperatura es de 30 a 42 grados centígrados.

17. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el segundo intervalo de temperatura es de 25 a 41 grados centígrados.

18. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la etapa de cambiar comprende el cambio cuando la densidad celular viable del cultivo está dentro de un intervalo de 6x106 células/ml a 12 x 106 células/ml, de tal manera que las células comenzarán a captar lactato durante el segundo período de tiempo.

19. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la etapa de cambio comprende el cambio cuando la concentración de lactato del cultivo es de menos de 8 gramos por litro, de tal manera que las células comenzarán a captar lactato durante el segundo período de tiempo.

20. El procedimiento de la reivindicación 7, que incluye una segunda etapa de cambio posterior a la primera etapa de cambio que comprende cambiar el cultivo a una tercera temperatura o intervalo de temperatura, en el que al menos una temperatura del tercer intervalo de temperatura es menor que la temperatura más baja del segundo intervalo de temperaturas.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el tercer intervalo de temperatura es de 25 a 40 grados centígrados.

22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 21, en el que el polipéptido es aíslado y purificado.

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el polipéptido es seleccionado del grupo que consiste en: una enzima, un receptor, un anticuerpo, una hormona, un factor regulador, un antígeno, un agente de unión, un factor de coagulación, un factor de crecimiento, y combinaciones de los mismos.

24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el polipéptido es un anticuerpo.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-ABeta.

26. El procedimiento de la reivindicación 24 o 25, en el que el anticuerpo se une a un epítopo con más fuerza, con más especificidad, o ambos, que un anticuerpo producido en condiciones de otro modo idénticas en un medio de otro modo idéntico que carece de la sustancia inhibidora de la glucólisis.