Secuencias de circovirus asociado con la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP).

1. Procedimiento para la detección y/o identificación en una muestra biológica de un circovirus MAP de tipo B,

caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto dicha muestra biológica con un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 90% con la secuencia SEC ID Nº 12 y que se corresponde con el ORF'2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico del circovirus MAP de tipo B presentado mediante al menos un polipéptido seleccionado entre la SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 20, y

b) detectar los complejos antígeno-anticuerpo formados eventualmente.

Secuencias de circovirus asociado con la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP)

La invención se refiere a procedimientos de detección de polipéptidos, a kits de diagnóstico de infecciones por el circovirus MAP de tipo B. La descripción tiene por objeto la secuencia genómica y las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos del circovirus MAP, tales como los polipéptidos estructurales y no estructurales de dicho circovirus, así como los vectores que incluyen dichas secuencias y células o animales transformados con dichos vectores. La descripción se refiere a procedimientos de detección de dichos ácidos nucleicos. La invención se refiere finalmente a anticuerpos monoclonales y policlonales que pueden reconocer de forma específica los polipéptidos aislados que tienen las secuencias SEC. ID Nº 17-20.

La invención se refiere a los procedimientos de detección y/o identificación de un circovirus MAP de tipo B en una muestra biológica, que comprende un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEC. ID Nº 12 y que corresponde a un ORF’2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico de un circovirus MAP de tipo B presentado por al menos un polipéptido seleccionado entre SEC. ID Nº 17, SEC. ID Nº 18, SEC. ID Nº 19, y SEC. ID Nº 20, y la detección de los complejos antígeno-anticuerpo eventualmente formados.

La invención se refiere además a kits de diagnóstico de una infección por circovirus MAP de tipo B es una muestra biológica, que comprende un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia SEC. ID Nº 12 y que corresponde a un ORF’2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico de un circovirus MAP de tipo B presentado por al menos un polipéptido seleccionado entre SEC. ID Nº 17, SEC. ID Nº 18, SEC. ID Nº 19, y SEC. ID Nº 20, y la detección de los complejos antígeno-anticuerpo eventualmente formados La memoria descriptiva se refiere también a un método de selección de compuestos que puedan modular la infección vírica. La memoria descriptiva comprende finalmente composiciones farmacéuticas, especialmente vacunales, para la prevención y/o el tratamiento de infecciones víricas por circovirus MAP así como el uso de un vector de acuerdo con la descripción para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades mediante terapia génica.

Se ha descrito ampliamente la enfermedad del adelgazamiento del lechón (MAP) o también denominada decaimiento fatal del lechón (DFP) en América del Norte (Harding, J.C., 1997) , y unos autores han relatado la existencia de una relación entre esta patología y la presencia de circovirus porcino (Daft, B. et al., 1996; Clark, E.G., 1997; Harding, J.C., 1997; Harding, J.C. y Clark, E.G., 1997; Nayar, G.P. et al., 1997) . Ya se ha demostrado un circovirus porcino en unos cultivos celulares derivados del cerdo establecidos en línea e infectados crónicamente (Tischer, I., 1986, 1988, 1995; Dulac, G.C., 1989; Edwards, S., 1994; Allan, G.M., 1995 y McNeilly, F., 1996) . Este virus, durante una infección experimental de lechones, no resultaba ser patógeno para el cerdo (Tischer, I., 1986, Homer, G.W., 1991) y se ha determinado y caracterizado su secuencia nucleotídica (Tischer, I., 1982; Meehan, B. M. et al., 1997; Mankertz, A., 1997) . El circovirus porcino, denominado virus PCV, pertenece al género circovirus de la familia de los circoviridae (Murphy, F.A. et al., 1995) cuyo virión posee un ADN circular de tamaño comprendido entre 1, 7 y 2, 3 kb, ADN que comprende 3 marcos abiertos de lectura (ORF1 a ORF3) , que codifica para una proteína de replicación REP implicada en la fase de iniciación y de terminación de la replicación circular desarrolladora (RCR) (Heyraud-Nitschke, F., et al., 1995; Harding, M.R. et al., 1993; Hanson, S.F. et al., 1995; Fontes, E.P.B. et al., 1994) , que codifica para una proteína de cápside (Boulton, L.H. et al., 1997; Hackland, A.F. et al., 1994; Chu P.W.G. et al., 1993) y que codifica para una proteína no estructural denominada de diseminación (Lazarowitz, S.G. et al., 1989) .

Los autores de la presente invención han observado que las manifestaciones clínicas perceptibles en el cerdo y relacionadas con la infección por el circovirus MAP, están muy individualizadas. Estas manifestaciones aparecen en general en unos cerdos de 8 a 12 semanas de edad, destetados desde 4 a 8 semanas. Las primeras señales son la hipotonía sin que se llegue a hablar de postración. Rápidamente (48 horas) los flancos se ahuecan, se marca la línea de la espalda, los cerdos “blanquean”. Estas señales se acompañan en general de hipertermia, de anorexia y lo más frecuentemente de manifestaciones respiratorias (tos, disnea, polipnea) . Pueden aparecer asimismo unas diarreas transitorias. La fase de estado de la enfermedad tarda aproximadamente un mes al final del cual los porcentajes de mortalidad varían de 5 a 20%. A estas mortalidades conviene añadir una proporción variable (5-10%) de animales cadavéricos que ya no pueden presentar ningún futuro económico. Se debe observar que fuera de este estado crítico de fin de post-destetado, no aparece ninguna anomalía en las ganaderías. En particular, la función de reproducción se mantiene perfectamente.

En el plano epidemiológico, las primeras manifestaciones de esta patología han aparecido a principios de 1995 en el Este del departamento de las Côtes d'Armor en Francia, y las ganaderías afectadas se han acantonado sobre todo en esta zona del departamento. En diciembre de 1996, no se puede evaluar con precisión el número de ganaderías afectadas debido a la ausencia de un método de diagnóstico específico en laboratorio ni un dispositivo de epidemiovigilancia del ganado. Basándose en los hechos clínicos así como en los resultados de exámenes necrópsicos suministrados por los veterinarios, se puede estimar este número en varias decenas (80-100) . La contagiosidad de la enfermedad es baja a moderada. Se han señalado unos casos fuera de la zona inicial y son el

resultado en su mayoría de la transferencia de animales procedentes de ganaderías que conocen el problema. Sin embargo, una particularidad de la afección es su alta persistencia. Así, unas ganaderías afectadas desde hace un año están todavía afectadas a pesar de la aplicación masiva de terapéuticos. Las ganaderías con expresión clínica se reclutan en las diferentes categorías de especialización (crías-cebadores, post-destetados-cebadores) y diferentes estructuras económicas están afectadas. Por otro lado, los trastornos aparecen incluso en unas ganaderías en las que se respetan las reglas de zootecnia.

Se han realizado numerosos exámenes necrópsicos o bien en las ganaderías o bien en el laboratorio. Los elementos de la tabla relativa a las lesiones son disparatados. Las lesiones macroscópicas más constantes son la neumonía que se presenta a veces en cuadrícula, así como una hipertrofia de los ganglios linfáticos. Las demás lesiones se refieren sobre todo a las vísceras torácicas incluyendo en particular la pericarditis y la pleuresía. Pero se observan asimismo unas artritis y unas úlceras gástricas. Las lesiones reveladas en el examen histológico se sitúan esencialmente a nivel pulmonar (neumonía intersticial) , ganglionar (depleción linfoide de los nudos linfáticos, células gigantes) y renal (glomerulonefritis, vascularitis) . Los agentes infecciosos han sido objeto de amplias investigaciones. Se ha podido excluir la intervención de los pestivirus y de la enfermedad de Aujeszky. Los trastornos aparecen en los ganados SDRP (síndrome disgenésico y respiratorio porcino, infección relacionada con un arteriovirus) seropositivos, pero no se ha podido establecer la función de este último en la génesis de los trastornos (la mayoría de las ganaderías de Bretaña son SDRP seropositivas) .

Los autores de la presente invención, con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable de la MAP, han realizado unas pruebas de “contacto” entre lechones manifiestamente “enfermos” y unos cerdos EOPS (Exentos de Organismos Patógenos Específicos) del CNEVA (Centro Nacional de Estudios Veterinarios y Alimenticios, Francia) . Estas pruebas han permitido observar el desarrollo en los animalarios protegidos de las manifestaciones comparables con las observadas en ganaderías. Las manifestaciones discretas tales como la hipertermia moderada, la anorexia y la diarrea intermitente, han aparecido después de una semana de contacto. Se debe observar que el virus SDRP únicamente se ha difundido posteriormente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la detección y/o identificación en una muestra biológica de un circovirus MAP de tipo B, caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto dicha muestra biológica con un polipéptido aislado codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 90% con la secuencia SEC ID Nº 12 y que se corresponde con el ORF’2 de un circovirus de tipo B, comprendiendo dicho polipéptido un epítopo específico del circovirus MAP de tipo B presentado mediante al menos un polipéptido seleccionado entre la SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 20, y

b) detectar los complejos antígeno-anticuerpo formados eventualmente.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido aislado comprende al menos una secuencia seleccionada entre: SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19 y SEC ID Nº 20.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho polipéptido está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 95% con la secuencia SEC ID Nº 12

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido está codificado por 15 una secuencia de nucleótidos idéntica a la secuencia SEC ID Nº 12.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia SEC ID Nº 15.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia idéntica a la secuencia SEC ID Nº 15.

7. Kit o estuche para la detección y/o identificación en una muestra biológica de un circovirus MAP de tipo B, que comprende:

a) un polipéptido aislado definido según una de las reivindicaciones 1 a 6, y b) un reactivo para la creación de un medio adecuado para la realización de una reacción antigénica.