SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS CODIFICANTE DE UNA ENZIMA CON ACTIVIDAD DEXTRANSACARASA, CÉLULAS QUE LA EXPRESAN Y SU USO PARA LA OBTENCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDOS CON ACTIVIDAD ANTIVIRAL Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN.

Secuencia de nucleótidos codificante de una enzima con actividad dextransacarasa,

células que la expresan y su uso para la obtención de exopolisacáridos con actividad antiviral y composiciones que los contienen.

La presente invención trata de una nueva secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima con actividad dextransacarasa aislada a partir de una cepa bacteriana de Lactobacillus sakei, más concretamente de fiambre de magro de cerdo, que presenta capacidad para producir un exopolisacárido. La invención se refiere también al procedimiento de obtención y purificación de dicho exopolisacárido así como al uso del exopolisacárido como agente antiviral en el tratamiento de especies piscícolas, principalmente salmónidos. La invención también protege composiciones farmacéuticas veterinarias o alimentarias que contienen dicho exopolisacárido.

SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS CODIFICANTE DE UNA ENZIMA CON ACTIVIDAD DEXTRANSACARASA, CÉLULAS QUE LA EXPRESAN Y SU USO PARA LA OBTENCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDOS CON ACTIVIDAD ACTIVIRAL Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se circunscribe dentro del sector de la biotecnología y se refiere a una nueva cepa bacteriana y a una secuencia de nucleótidos codificante de una enzima con actividad dextransacarasa, con capacidad para producir un exopolisacárido con actividad antivírica y a un procedimiento para producir dicha enzima y dicho compuesto. Esta invención se refiere, además, a composiciones alimentarias o farmacéuticas veterinarias que contienen el exopolisacárido y que son de aplicación en el sector de la acuicultura para combatir enfermedades infecciosas virales, principalmente en salmónidos.

ESTADO DE LA TECNICA

Las bacterias ácido lácticas son microorganismos considerados GRAS (Generally Recognized as Safe) y algunas de estas bacterias son capaces de sintetizar polisacáridos extracelulares (EPS) tanto heteropolisacáridos como homopolisacáridos. Las propiedades de dichos EPS están determinadas por: (i) el tipo de enlace y unidades de monosacáridos que lo formen, (ii) su grado y tipo de ramificación, y (iii) tanto su masa molecular como su conformación.

Los a-glucanos son homopolisacáridos y se clasifican en función del tipo de enlace a- glicosídico que une las diferentes moléculas de glucosa. Los dextranos, presentan principalmente uniones a-(1>6) (Robyt y Walseth (1979) Carbohydr. Res. 68:95-111). Los reuteranos poseen uniones a-(1>4) (Kralj, van Geel-Schutten, Dondorff, Kirsanovs, van der Maarel y Dijkhuizen (2004) Microbiology 150: 3681-3690). Los mutanos, contienen uniones a-(1>3) (Shiroza, Ueda, y Kuramitsu (1987) J. Bacteriol. 169:4263-4270) y los altérnanos, como su nombre indica, alternan uniones a-(1>3) y uniones a-(1>6) (Arguello-Morales, Remaud-Simeon, Pizzut, Sargabal, Willemot y Monsan (2000) FEMS Microbiol. Lett. 182:81- 85). Las especies bacterianas capaces de sintetizarlos son bacterias lácticas pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Weisella (Amari, Gómez Arango,

Gabriel, Robert, Morel, Moulis, Gabriel, Remaun-Siméon y Fontagné-Faucher (2012) Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI 10.1007/s00253-012-4447-8) (Rühmkorf, Bork, Mischnick, Rübsam, Beckery Vogel (2013) Food Microbiol. 34 (2013) 52-61).

Los a-glucanos son sintetizados por glucansacarasas también conocidas como glucosiltransferasas. Estas enzimas pertenecen a la familia de las glicosil-hidrolasas (GH70) con cuatro tipos de dominios estructurales en base a su secuencia de aminoácidos: (i) un péptido señal en su extremo amino terminal, (ii) una región variable, (iii) un dominio catalítico y (d) una región carboxilo terminal (van Hijum, Kralj, Ozimek, Dijkhuizen y van Geel-Schutten (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:157-176).

Las dextransacarasas (EC 2.4.1.5) son enzimas secretadas al medio o que permanecen unidas a la superficie de la célula. Estas enzimas sintetizan dextrano utilizando como sustrato sacarosa y catalizando la siguiente reacción química: sacarosa+(1,6-a-D- glucosil)n>D-fructosa+(1,6-a-D-glucosil)n+1. Los dextranos presentan diferentes tipos de ramificaciones: a-(1->3); a-(1>2) o a-(1>4) y presentan un elevado peso molecular (superior a 106 Da). En presencia de aceptares eficientes, como la maltosa, la reacción se desplaza hacia la síntesis de oligosacáridos de interés como prebióticos (Ruiz-Matute, Brokl, Sanz, Soria, Cóté, Collins y Rastal (2011) J. Agrie. Food Chem., 59:3693-3700). Las dextransacarasas de las especies de Streptococcus en general se producen de forma constitutiva, mientras que las de las especies de Leuconostoc son inducidas por sacarosa, aunque se han conseguido mutantes constitutivos.

El dextrano sintetizado por Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F fue uno de los primeros biopolímeros producidos a escala industrial con varias aplicaciones en biotecnología y medicina. El dextrano se lleva empleando hace mucho tiempo como espesante, como sustituto de plasma sanguíneo y como matriz en columnas de Sephadex® (Naessens, Cerdobbel, Soetaert y Vandamme (2005) J. Chem. Technol. Biotechnol. 80:845- 860). En la actualidad, el número de bacterias productoras de dextrano ha ido en aumento junto a nuevas aplicaciones del mismo como prebiótico, agente bioactivo y/o agente anticorrosión, en cosmética y en productos horneados (US0059633; US6399119; US8263380; US0165290).

Ciertos tipos de dextrano, como el dextrano sulfatado, también se han empleado para combatir ciertos virus como son el del dengue (Alen y Schols (2012) J. Tropical Medicine

doi: 10.1155/2012/628475) ó el virus de la influenza (Yamada, Moriishi, Haredy, Takenaka, Mori, Yamanishi y Okamoto (2012) Antiviral Res. 96:344-352).

Por otra parte, actualmente en acuicultura las enfermedades infecciosas de origen vírico provocan grandes pérdidas económicas. Entre los virus de salmónidos más relevantes se encuentran, el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) y el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI) que son capaces de inducir persistencia, y en animales supervivientes a la infección se produce un estado de portador asintomático, que implica mayor dificultad para la erradicación del virus. Además, el VNPI se está aislando últimamente en el medio marino en especies de alto valor comercial, como el salmón del Atlántico, al que causa altas mortalidades. El impacto económico es aún mayor si además se producen coinfecciones con otro virus, como por ejemplo el de la anemia infecciosa del salmón (VAIS), un orthomixovirus emergente en países productores.

Aunque existen vacunas de ácido desoxirribonucleico (ADN) probadas a nivel de laboratorio que han mostrado ser eficaces (de las Heras, Rodríguez Saint-Jean y Pérez-Prieto (2010) Fish Shellfish Immunol. 27:120-129), en la actualidad sólo se está utilizando en piscifactorías una vacuna de ADN en Canadá contra el VNHI (Salonius, Simard, Harland y Ulmer (2007) Curr. Opin. Invest. Drugs 8:635-641).

En base a lo anterior, la invención que aquí se presenta tiene gran interés dentro de la búsqueda de estrategias para combatir las infecciones víricas, como son las vacunas y los suplementos dietéticos incluyendo prebióticos, que ayuden a mejorar la resistencia contra las enfermedades infecciosas en acuicultura.

EXPLICACION DE LA INVENCION

Breve descripción de la invención

Un objeto de la invención lo constituye una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de nucleótidos de la invención, caracterizada por que se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 4.

Una realización particular de la invención la constituye una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la secuencia de nucleótidos SEQ

ID NO: 4 y por que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.

Otro objeto de la invención la constituye un vector de expresión tipo procariota o eucariota, en adelante vector de expresión de la invención, que comprende la SEQ ID NO: 4, o una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la SEQ ID NO: 4 y que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.

Una realización particular de la invención la constituye el vector de expresión de la invención, que comprende la SEQ ID NO: 6.

Otro objeto de la invención lo constituye una enzima con actividad dextransacarasa útil para la obtención de un exopolisacárido, en adelante enzima dextransacarasa de la invención, que está codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención, o por una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la SEQ ID NO: 4.

Otra realización particular de la invención la constituye la enzima dextransacarasa de la invención constituida por la SEQ ID NO: 5.

Otro objeto de la invención lo constituye una célula útil para obtener exopolisacáridos, en adelante célula de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención, preferentemente la SEQ ID NO: 4, o un vector de expresión de la invención.

Otra realización particular de la invención la constituye la célula de la invención que se corresponde con la cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la célula de la invención para la obtención de una enzima con actividad dextransacarasa que comprende la SEQ ID NO: 5.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la célula de la invención en un procedimiento... [Seguir leyendo]

1.- Una secuencia de nucleótidos caracterizada por que se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 4.

2.- Una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y por que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.

3 - Vector de expresión tipo procariota o eucariota caracterizado por que comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

4 - Vector de expresión según la reivindicación 3 caracterizada por que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

- Una enzima con actividad dextransacarasa útil para la obtención de un exopolisacárido, caracterizada por que está codificada por una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

6.- Una enzima con actividad dextransacarasa según la reivindicación 5 caracterizada por que está constituida por la SEQ ID NO: 5.

7.- Una célula caracterizada por que comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 2 o un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4.

8.- Una célula según la reivindicación 7 caracterizada por que se corresponde con una cepa Lactobacillus sakei con capacidad para producir un exopolisacárido.

9.- Una célula según la reivindicación 8, caracterizada por que la cepa bacteriana Lactobacillus sakei se aísla de fiambre de magro de cerdo.

10.- Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 9 caracterizada porque se corresponde con la cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329.

11.- Uso de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 10 para la obtención de una enzima con actividad dextransacarasa según una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6.

12.- Uso de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 10 en un procedimiento útil para la obtención de un exopolisacárido.

13.- Procedimiento de obtención de un exopolisacárido según la reivindicación 12

caracterizado por que la célula es una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a la 10 y por que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una bacteria L. sakei en medio de cultivo suplementado con al menos un azúcar, seleccionado de entre sacarosa y maltosa, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento del exopolisacárido;

b) eliminar las bacterias por centrifugación y separar el sobrenadante;

c) añadir un alcohol o una cetona para obtener un precipitado del exopolisacárido; y

d) centrifugar el precipitado del paso (c) para eliminar el sobrenadante, y obtener un exopolisacárido precipitado.

14.- Procedimiento de obtención de un exopolisacrárido según la reivindicación 13,

caracterizada por que incluye una fase de purificación posterior a la etapa (d) que comprende las siguientes etapas:

i.- resuspender el exopolisacárido precipitado según la etapa (d) en agua ultrapura;

ii.- someter al exopolisacárido a una diálisis utilizando membranas de 12-13 kDa, con cambios de agua; y

ni.- congelar a una temperatura entre -60 y -80 °C y liofilizar.

- Procedimiento de obtención de un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14 caracterizado por que la cepa L. sakei de la etapa (a) es la cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329.

16.- Procedimiento de obtención de un exopolisacárido según una cualquiera de las

reivindicaciones 5 y 6 caracterizado por que utiliza una enzima de actividad

dextransacarasa.

17.- Un exopolisacárido obtenido a través del procedimiento de obtención según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a la 16.

18. Un exopolisacárido según la reivindicación 17, caracterizado por que es un dextrano.

19.- Uso de un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de

infecciones virales de especies piscícolas, preferiblemente salmónidos.

20.- Uso según la reivindicación 19 caracterizado por que el virus pertenece a los géneros Birnavirus o Rhabdovirus, y preferentemente es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI).

21.- Composición farmacéutica veterinaria o alimentaria útil para la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas caracterizada por que comprende un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18.

22.- Composición según la reivindicación 21 caracterizada por que el virus pertenece a los

géneros Birnavirus o Rhabdovirus, y preferentemente es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI).