Recombinación homóloga mediada por nucleasas con dedos de zinc.

Un método para introducir una secuencia exógena en el genoma de una célula de planta,

comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto la célula con un vector de ADN donador que comprende una primera, segunda y quinta secuencias de ADN, y la quinta secuencia de ADN comprende la secuencia exógena del vector de ADN que se va a introducir y está interpuesta entre la primera y segunda secuencias del vector de ADN donador;

en donde la primera secuencia tiene al menos de 90% a 95% de homología con una tercera secuencia en el genoma de la célula de planta, la segunda secuencia tiene al menos de 90% a 95% de homología con una cuarta secuencia en el genoma de la célula de planta, en donde la tercera y cuarta secuencias en el genoma de la célula de planta son secuencias de ADN cromosómico y los bordes cercanos de la tercera y cuarta secuencias están separados por al menos un par de nucleótidos; y

(b) expresar una o más nucleasas en la célula, en donde la una o más nucleasas son cada una un par de proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión es una fusión entre el dominio de escisión de una endonucleasa de restricción FokI y un dominio de unión con dedos de zinc genéticamente modificado, y en donde la una o más nucleasas escinden el ADN cromosómico en una o más secuencias diana correspondientes entre la tercera y cuarta secuencias, en donde la una o más nucleasas escinden el ADN cromosómico en una localización de 0,4 a 3 kilopares de bases de la tercera o cuarta secuencias en el genoma de la célula de planta;

de modo que la escisión del ADN cromosómico en la etapa (b) estimula la incorporación de la quinta secuencia de ADN en el genoma por recombinación homóloga.

Recombinación homologa mediada por nucleasas con dedos de zinc Campo técnico

La presente descripción está en el campo de la ingeniería genómica, reconocimiento génico, integración cromosómica dirigida y expresión de proteínas en plantas.

Antecedentes

Un campo de interés principal en la agricultura, en especial a la luz de la determinación de las secuencias de nucleótidos completas de una serie de genomas de plantas, es la alteración dirigida de secuencias genómicas. En particular, la capacidad para convertir secuencias endógenas de plantas facilitarla numerosas aplicaciones tales como, por ejemplo, la optimización de características de los cultivos que afectan al valor nutricional, rendimiento, tolerancia al estrés, resistencia a patógenos y resistencia a compuestos agroqulmicos y/o la adaptación de plantas para usar como fábricas biológicas para la producción de compuestos farmacéuticos o productos químicos industriales.

En eucariotas, se han hecho intentos de alterar secuencias genómicas en células cultivadas aprovechando el fenómeno natural de la recombinación homologa. Véase, por ejemplo, Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; patentes de EE.UU. n° 6.528.313 y 6.528.314. Si un polinucleótido tiene suficiente homología con la región genómica que contiene la secuencia que se va a alterar, es posible que parte o toda la secuencia del polinucleótido sustituya la secuencia genómica por recombinación homologa. Sin embargo, la frecuencia de la recombinación homologa en estas circunstancias es extremadamente baja. Además, la frecuencia de inserción del polinucleótido exógeno en sitios genómicos que carecen de homología de secuencia supera la frecuencia de la recombinación homologa en varios órdenes de magnitud.

La introducción de una rotura blcatenaria en el ADN genómico, en la región del genoma que contiene homología con un polinucleótido exógeno, se ha mostrado que simula la recombinación homologa en este sitio en varios miles de veces en células cultivadas. Rouet et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:896-816; Choulika et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973; Donoho et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:47-478. Véase también Johnson et al. (21) Biochem. Soc. Trans. 29:196-21; y Yanez et al. (1998) Gene Therapy 5:149-159. En estos métodos, la escisión del ADN en la región genómica deseada se llevaba a cabo por inserción de un sitio de reconocimiento para una meganucleasa (es decir, una endonucleasa cuya secuencia de reconocimiento es tan grande que no se produce, o se produce raramente en el genoma de interés) en la región genómica deseada.

Sin embargo, la recombinación homologa estimulada por escisión por meganucleasa se basa en la presencia fortuita o en la inserción dirigida de un sitio de reconocimiento de la meganucleasa adecuado en la proximidad de la región genómica que se va a alterar. Puesto que los sitios de reconocimiento de las meganucleasas son raros (o no existen) en un genoma de planta típico, y la inserción de un sitio de reconocimiento de meganucleasa adecuado está lleno de las mismas dificultadas asociadas con otras alteraciones genómicas, estos métodos no son ampliamente aplicables.

Por lo tanto, siguen siendo necesarias composiciones y métodos para la alteración dirigida de secuencias en cualquier genoma de planta, y composiciones y métodos para la introducción dirigida de secuencias exógenas en un genoma.

Durai et al., Nucleic Acids Research, 25, Vol. 33, 5978-599 se refiere a las nucleasas con dedos de zinc como tijeras moleculares diseñadas de forma personalizada para la ingeniería genómica de la planta y células de mamíferos.

Porteus y Carroll, Nature Biotechnology, 25, Vol. 23, 967-973 se refiere al reconocimiento génico usando nucleasas con dedos de zinc.

Compendio

La presente invención se define mediante el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

La presente descripción proporciona composiciones y métodos para la escisión dirigida de la cromatina celular en una región de interés y/o la recombinación homologa en una región predeterminada de interés en células de plantas. Las células de plantas pueden ser de especies de plantas monocotiledóneas (monoctas) o dicotiledóneas (dicotas), y también se incluyen células cultivadas, células en una planta en cualquier etapa del desarrollo y células de plantas que se han separado de la planta entera y cuyas células (o sus descendientes) se devolverán a la planta.

Una región de interés en la cromatina celular puede ser, por ejemplo, una secuencia genómica o parte de la misma. Las composiciones incluyen polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión con dedos de zinc genéticamente modificado (p. ej., un dominio de unión con dedos de zinc que tiene una especificidad nueva) y un dominio de escisión, y polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión con dedos de zinc

genéticamente modificado y un semidominio de escisión. Los dominios de escisión y semidominios de escisión se pueden obtener, por ejemplo, de diferentes endonucleasas de restricción y/o endonucleasas de asentamiento.

En un aspecto, se describe en la presente memoria un vector que comprende una primera y segunda secuencias de ADN, en donde (i) la primera secuencia es homologa con una tercera secuencia y la segunda secuencia es homologa con una cuarta secuencia; (ii) la tercera y cuarta secuencias son secuencias de ADN cromosómico; y (iii) los bordes cercanos de la tercera y cuarta secuencias están separados por al menos 1 par de nucleótidos. En algunas realizaciones, la tercera y cuarta secuencias son secuencias endógenas.

En cualquiera de los vectores descritos en la presente memoria, al menos una de la primera o segunda secuencias tiene una longitud de 1 nucleótidos. Además, cualquier de los vectores descritos en la presente memoria puede comprender una quinta secuencia, en donde la quinta secuencia: (a) está interpuesta entre la primera y segunda secuencias; y (b) es una secuencia exógena. En algunas realizaciones, la quinta secuencia tiene un tamaño de al menos 1 par de bases, pero puede ser tan grande como de 22 kilopares de bases.

Los vectores (p. ej., la quinta secuencia) pueden comprender también secuencias que codifican una proteína o partes de una proteína. En algunas realizaciones, la secuencia que codifica proteína codifica un marcador seleccionable (p. ej., proteína verde fluorescente (GFP), IJ-glucuronldasa (GUS), fosfinotricina N-acetlI-transferasa (PAT, BAR), neomicina fosfotransferasa, I3-Iactamasa, catecol dloxlgenasa, a-amllasa, tirosinasa, (3-galactosldasa, luciferasa, aequorina, EPSP sintasa, nitrilasa, acetolactato sintasa (ALS), dihidrofolato reductasa (DHFR), dalapon deshalogenasa y antranilato sintasa). En otras realizaciones, la secuencia que codifica proteína (p. ej., la quinta secuencia) codifica una proteína o parte de proteína, por ejemplo, una secuencia que es homologa con secuencias cromosómlcas.

En otras realizaciones más, los vectores (p. ej., la quinta secuencia) comprende una o más secuencias reguladoras transcrlpclonales. En otras realizaciones más, los vectores (p. ej., la quinta secuencia) puede comprender un equivalente natural de una secuencia cromosómica mutante, o alternativamente un equivalente muíante de una secuencia cromosómica natural.

En cualquiera de los vectores descritos en la presente memoria, la primera secuencia tiene una homología de al menos 9% a 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 1% con la cuarta secuencia.

En otro aspecto más, se describe en la presente memoria un método para introducir una secuencia exógena en el genoma de una célula de planta, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto la célula con cualquiera de los vectores descritos antes; y (b) expresar una o más nucleasas en la célula, en donde la una o más nucleasas escinden el ADN cromosómico en el espacio entre ,4 y 3 kilopares de bases de cualquiera de la tercera o cuarta secuencias; de modo que la escisión del ADN cromosómico en la etapa (b) estimula la incorporación del vector director en el genoma por recombinación homologa.

La una o más nucleasas son fusiones entre el dominio de escisión de una endonucleasa de restricción Fokl y un dominio de unión con dedos de zinc genéticamente modificado.

También se describe en la presente memoria, un método para expresar una proteína en una célula de planta, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto la célula con un vector como se describe en la presente memoria; y (b) expresar una o más nucleasas en la célula, en donde la una o más nucleasas escinden el ADN cromosómico en el espacio entre ,1 y 3 kilopares de bases de cualquiera de la tercera... [Seguir leyendo]

1. Un método para introducir una secuencia exógena en el genoma de una célula de planta, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto la célula con un vector de ADN donador que comprende una primera, segunda y quinta secuencias de ADN, y la quinta secuencia de ADN comprende la secuencia exógena del vector de ADN que se va a introducir y está interpuesta entre la primera y segunda secuencias del vector de ADN donador;

en donde la primera secuencia tiene al menos de 9% a 95% de homología con una tercera secuencia en el genoma de la célula de planta, la segunda secuencia tiene al menos de 9% a 95% de homología con una cuarta secuencia en el genoma de la célula de planta, en donde la tercera y cuarta secuencias en el genoma de la célula de planta son secuencias de ADN cromosómico y los bordes cercanos de la tercera y cuarta secuencias están separados por al menos un par de nucleótidos; y

(b) expresar una o más nucleasas en la célula, en donde la una o más nucleasas son cada una un par de proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión es una fusión entre el dominio de escisión de una endonucleasa de restricción Fokl y un dominio de unión con dedos de zinc genéticamente modificado, y en donde la una o más nucleasas escinden el ADN cromosómico en una o más secuencias diana correspondientes entre la tercera y cuarta secuencias, en donde la una o más nucleasas escinden el ADN cromosómico en una localización de ,4 a 3 kilopares de bases de la tercera o cuarta secuencias en el genoma de la célula de planta;

de modo que la escisión del ADN cromosómico en la etapa (b) estimula la incorporación de la quinta secuencia de ADN en el genoma por recombinación homologa.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia exógena es un marcador seleccionable.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el marcador seleccionable se selecciona del grupo que consiste en la proteína verde fluorescente (GFP), ft-glucuronidasa (GUS), fosfinotricina N-acetil-transferasa (PAT, BAR), neomicina fosfotransferasa, ft-lactamasa, catecol dioxigenasa, a-amilasa, tirosinasa, (3-galactosidasa, luciferasa, aequorina, EPSP sintasa, nitrilasa, acetolactato sintasa (ALS), dihidrofolato reductasa (DHFR), dalapon deshalogenasa y antranilato sintasa.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la quinta secuencia comprende una o más secuencias reguladoras de la transcripción.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la quinta secuencia comprende secuencias que codifican una proteína o una parte de una proteína.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la quinta secuencia comprende un equivalente natural de una secuencia cromosómica muíante, o un equivalente muíante de una secuencia cromosómica natural.