Purificación de proteínas basada en la no afinidad.

Un método para purificar una proteína diana a partir de una mezcla que contiene una proteína de una célula hospedadora,

que comprende someter dicha mezcla a:

(a) una primera etapa de purificación de no afinidad, y

(b) una segunda etapa de purificación de no afinidad, seguido de

(c) filtración de flujo tangencial de alto rendimiento (FTTAR), y

(d) aislar dicha proteína hasta una pureza que contiene menos de 100 partes por millón (ppm) de dicha proteína de la célula hospedadora,

en el que dicha primera etapa de purificación de no afinidad es la cromatografía de intercambio catiónico y dicha segunda etapa de purificación de no afinidad es cromatografía de intercambio aniónico y en donde el método incluye una etapa de purificación de no afinidad.

Purificación de proteínas basada en la no afinidad Antecedentes de ¡a invención Campo de ia invención

Esta invención se refiere en general a la purificación de proteínas. En particular, la invención se refiere a un método para la purificación de proteínas (tales como anticuerpos y moléculas similares a anticuerpos, por ejemplo ¡nmunoadheslnas) de una composición que comprende el polipéptido y al menos una impureza sin el uso de cromatografía de afinidad.

Descripción de la técnica relacionada

La purificación de proteínas económica a gran escala es un problema cada vez más importante para la industria de la biotecnología. Generalmente, las proteínas se producen mediante cultivo celular, utilizando líneas celulares de mamífero o bacterianas manipuladas para que produzcan la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, deben ser alimentados con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, por lo general suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos suministrados a las células y de los subproductos de las propias células hasta una pureza suficiente para su uso como agente terapéutico humano plantea un desafío formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de residuos celulares dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Algunas proteínas son secretadas directamente desde la célula en el medio de crecimiento circundante; otras se fabrican ¡ntracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de purificación implica la lisis de la célula, que se puede hacer mediante diversos métodos, incluyendo cizalla mecánica, choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Esta rotura libera el contenido completo de la célula en el homogeneizado y, además, produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. Estos generalmente se retiran por centrifugación o por filtración. El mismo problema surge, aunque a menor escala, con proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de las proteínas intracelulares de la célula hospedadora en el curso del ciclo de la producción de proteínas.

Una vez que se obtiene una solución que contiene la proteína de interés, su separación de las otras proteínas producidas por la célula normalmente se intenta utilizando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan las mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobicidad o tamaño. Se dispone de varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, lo que permite un ajuste preciso del esquema de purificación a la proteína concreta implicada. La esencia de cada uno de estos métodos de separación es que se puede hacer que las proteínas se muevan a diferentes velocidades en sentido descendente en una columna larga, lo que consigue una separación física que se incrementa a medida que desciende por columna o a adherirse de forma selectiva al medio de separación, eluyéndose diferencialmente mediante diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína deseada se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna y la proteína de interés no lo hace, es decir, la proteína de interés está presente en el "flujo continuo".

La cromatografía de intercambio iónico, llamada así por el contraión intercambiable, es un procedimiento aplicable a la purificación de moléculas ionizables. Las moléculas ionizadas se separan sobre la base de la interacción electrostática no específica de sus grupos cargados con moléculas de carga opuesta unidos a la matriz de soporte en fase sólida, retardando de este modo las moléculas ionizadas que ¡nteraccionan más fuertemente con la fase sólida. La carga neta de cada tipo de molécula ionizada, y su afinidad por la matriz, varía según el número de grupos cargados, la carga de cada grupo y la naturaleza de las moléculas que compiten por la interacción con la matriz en fase sólida cargada. Estas diferencias dan lugar a la resolución de diversos tipos de moléculas mediante cromatografía de intercambio iónico. En la purificación de proteínas típica usando cromatografía de intercambio iónico, una mezcla de muchas proteínas derivadas de una célula hospedadora, tal como en cultivo de células de mamífero, se aplica a una columna de intercambio iónico. Después de las moléculas que no se unen se eliminan mediante lavado, las condiciones se ajustan, tal como cambiando el pH, la concentración de contraiones y similares, en modo de etapas o de gradiente, para liberar de la fase sólida una proteína ionizada de interés retenida no específicamente o retardada de interés y separándola de las proteínas que tienen diferentes características de carga. La cromatografía de intercambio aniónico implica la competición de una molécula aniónica de interés con el contraión negativo por la interacción con una molécula cargada positivamente unida a la matriz en fase sólida al pH y en las condiciones de un proceso de separación particular. Por el contrario, la cromatografía de intercambio catiónico implica la competición de una molécula catiónlca de Interés con el contraión positivo por la Interacción con una molécula cargada negativamente unida a la matriz en fase sólida al pH y en las condiciones de un proceso de separación particular. La cromatografía de Intercambio Iónico de modo mixto Implica el uso de una combinación de

medios cromatográficos de intercambio catiónico y aniónico en la misma etapa. En particular, "de modo mixto" se refiere a una matriz de soporte de fase sólida a la que se une covalentemente una mezcla de intercambio catiónico, de intercambio aniónico y restos de interacción hidrofóbicos. Un representante disponible comercialmente de columnas cromatográficas de intercambio iónico de modo mixto es ABx cuyo uso se describe en los Ejemplos.

La cromatografía en hidroxiapatita de proteínas implica la interacción ¡nespecífica de los grupos carboxilato o amino cargados de una proteína con grupos de cargas opuestas sobre la hidroxiapatita, en los que la carga neta de la hidroxiapatita y la proteína están controladas por el pH del tampón. La elución se consigue mediante desplazamiento del apareamiento inespecífico de proteína-hidroxiapatita con iones tales como Ca^+ o Mg2+. Los grupos de proteínas cargadas negativamente son desplazados por los compuestos cargados negativamente, tales como fosfatos, eluyendo de este modo una proteína con carga neta negativa.

La cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) es útil para la purificación y separación de moléculas, tales como proteínas, basada en diferencias en su hidrofobicidad de la superficie. Los grupos hidrófobos de una proteína ¡nteraccionan de forma ¡nespecífica con grupos hidrófobos unidos a la matriz de la cromatografía. Las diferencias en el número y la naturaleza de los grupos hidrófobos de la superficie de la proteína tienen como resultado un retraso diferencial de las proteínas en una columna de CIH y, como resultado, la separación de las proteínas en una mezcla de proteínas.

La cromatografía de inducción de carga hidrófoba (CIH) es útil para la separación de moléculas biológicas, tales como proteínas, basado en el comportamiento dependiente del pH de ligandos ¡onizables, de modo dual (Boschetti, E. et al., Genetic Engineering News 20(13) (2000)). A pH neutro, el ligando está sin carga y se une a una proteína de interés a través de interacción hidrófoba ¡nespecífica leve. Como el pH se reduce durante un gradiente de tampón, el ligando se carga positivamente y la unión hidrófoba se altera mediante repulsión de la carga electrostática (Boschetti, E. (2000), citado anteriormente). Las condiciones suaves utilizadas en la CIH reduce el riesgo de desnaturalización de la proteína y la agregación de anticuerpos.

La cromatografía de afinidad, que explota una interacción específica dependiente estructuralmente (es decir, espacialmente complementaria) entre la proteína que se va a purificar y un agente de captura inmovilizado, es una opción de purificación estándar para algunas proteínas, tales como anticuerpos. La proteína A, por ejemplo, es un adsorbente útil para la cromatografía de afinidad de proteínas, tales como anticuerpos, que contienen una región Fe. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kDa de Sfapby/ococcus áureos que se une con una afinidad alta (aproximadamente... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar una proteína diana a partir de una mezcla que contiene una proteína de una célula hospedadora, que comprende someter dicha mezcla a:

(a) una primera etapa de purificación de no afinidad, y

(b) una segunda etapa de purificación de no afinidad, seguido de

(c) filtración de flujo tangencial de alto rendimiento (FTTAR), y

(d) aislar dicha proteína hasta una pureza que contiene menos de 100 partes por millón (ppm) de dicha proteína de la célula hospedadora,

en el que dicha primera etapa de purificación de no afinidad es la cromatografía de intercambio catiónico y dicha segunda etapa de purificación de no afinidad es cromatografía de intercambio aniónico y en donde el método incluye una etapa de purificación de no afinidad.

2. El método de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de cromatografía de intercambio catiónico se realiza en un ligando de intercambio catiónico seleccionado del grupo que consiste en carboximetilcelulosa, sulfopropilo (SP) y sulfonilo.

3. El método de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de cromatografía de intercambio catiónico se realiza en una resina de intercambio catiónico seleccionada del grupo que consiste en carboximetilcelulosa, sulfopropilo inmovilizado en agarosa y sulfonilo inmovilizado en agarosa.

4. El método de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de cromatografía de intercambio aniónico se realiza en un ligando de intercambio aniónico seleccionado del grupo que consiste en DEAE e iones de amonio cuaternario.

5. El método de la reivindicación 1 en el que dicha etapa de cromatografía de intercambio aniónico se realiza en una resina de intercambio amónico seleccionada del grupo que consiste en DEAE celulosa, QAE SEPHADEX^ y Q SEPHAROSETM.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la FFTAR se realiza utilizando una membrana cargada.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína de la célula hospedadora es proteína de ovario de hámster chino (CHOP).

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicha proteína diana es un anticuerpo.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo pollclonal.

11. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

12. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.

13. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, dlacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos blespecíflcos y anticuerpos multlespecíflcos formados a partir fragmentos de anticuerpos.

15. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, CD40, receptor EGF, receptores HER2, HER3 y HER4, LFA-1, Mad, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, ¡ntegrlna av/}33, CD11a, CD18, CDIIb, VEGF, IgE, receptor flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptor mp/, CTLA-4 y pollpéptldo C.

16. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en antl-HER2; anti-CD20; anti-IL-8; anti-VEGF; anti-PSCA; anti-CD11a; anti-lgE; anti-receptor de Apo-2; antl-TNF-a; antl-factor tisular (TF); anti-CD3; anti-CD25; anti-CD34; anti-CD40; anti-tac; anti-CD4; anti-CD52; anti-receptor de Fe; anticuerpos antiantígeno carcinoembrionario (CEA); anticuerpos dirigidos contra las células epiteliales de mama; anticuerpos que se unen a las células de carcinoma de colon; anticuerpos anti-CD33; anti-CD22; anti-EpCAM; anti- Gpllb/llla; anti-VSR; anti-CMV; anti-VIH; anti-hepatitis; anti-av)53; anti-carcinoma de células renales humano; ant¡-17- 1A humana; anti-tumor colorrectal humano; anti-melanoma humano; anti-carcinoma de células escamosas humano y antiantígeno leucocitario humano (HLA).

17. El método de la reivindicación 8, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-receptor HER2, anti-VEGF, anti-lgE, anti-CD20, anti-CD11a y anti-CD40.

18. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína diana es una inmunoadhesina.

19. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína diana es una molécula similar a anticuerpo.

20. El método de la reivindicación 19, en el que dicha molécula similar a anticuerpo es una proteína fusionada a, o conjugada con, una región CH2/CH3.

21. El método de la reivindicación 20 en el que dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en renina; hormonas de crecimiento, factor liberador de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; antitripsina alfa-1; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factor VIIIC, factor IX, factor tisular, factor de von Willebrand; proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; uroquinasa, activador del plasminógeno de tipo tisular y de la orina humana (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES, proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); seroalbúminas; sustancia inhibidora del factor muleriano; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; beta-lactamasa; DNasa; IgE; antígenos asociados con los linfocitos T citotóxicos (CTLA); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormonas o de factores de crecimiento; proteínas A o D; factores reumatoides; factor neurotrófico derivado de huesos (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, y -6 (NT-3, NT-4, NT-5 y NT-6), factores de crecimiento nervioso; factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factores de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factores de crecimiento transformante (TGF); factor de crecimiento insulinoide I y II (IGF-I y IGF-II); des(1-3)-IGF-l (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulinoide (IGFBP); proteínas CD; eritropoyetina; factores osteoinductores; immunotoxinas; proteínas morfogenéticas óseas (BMP); interferón-alfa, -beta y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), interleucinas IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerante del deterioro; antígenos virales; proteínas de transporte; receptores buscadores, adresinas; proteínas reguladoras; integrinas; antígenos asociados a tumor; y fragmentos de los mismos.

22. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de incorporación de la proteína aislada a una formulación farmacéutica.