Proteínas de unión específicas y de alta afinidad que comprenden dominios SH3 modificados de la quinasa Fyn.

Una proteína de unión recombinante que tiene una afinidad de unión específica a una proteína o péptido,

en donde dicha proteína o péptido no es un ligando de unión a SH3 natural, que comprende al menos un derivado del dominio de homología 3 de Src (SH3) de la quinasa FYN, en donde

(a) al menos un aminoácido en o localizado hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle src y

(b) al menos un aminoácido en o localizado hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle RT,

se sustituyen, delecionan o añaden, en donde el derivado del dominio SH3 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde dicho derivado del dominio SH3 tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que representa el dominio de homología 3 de Src (SH3) de la quinasa FYN fuera de los bucles src y RT y con la condición de que la proteína recombinante no sea una proteína que contiene un dominio SH3 natural existente en la naturaleza.

Proteínas de unión específicas y de alta afinidad que comprenden dominios SH3 modificados de la quinasa Fyn Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de unión recombinante como se define por las reivindicaciones, dicha proteína de unión recombinante comprende al menos un derivado del dominio de homología 3 de Src (SH3) de la quinasa FYN, en donde al menos un aminoácido en o localizado hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle src y al menos un aminoácido en o localizado hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle RT se sustituye, deleciona o añade. Además, la invención se dirige a proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión como se define por las reivindicaciones, fusionada a un componente farmacéuticamente y/o diagnósticamente activo. Además, la invención se refiere a nucleótidos que codifican estas proteínas de unión y/o de fusión así como a los correspondientes vectores y células huéspedes. Por último pero no menos importante, la presente invención se refiere al uso de las proteínas de unión y/o de fusión como se definen por las reivindicaciones para preparar un medicamento o un medio diagnóstico así como a composiciones farmacéuticas o diagnósticas que comprenden dichas proteínas de unión y/o de fusión.

Antecedentes de la invención

Los agentes de unión específicos y de alta afinidad son herramientas indispensables para la investigación biológica y médica y también tienen utilidad para el diagnóstico médico, profilaxis y tratamiento. Actualmente, los anticuerpos monoclonales son la clase predominante de moléculas de unión que se pueden aislar rápidamente con alta afinidad y especificidad hacia virtualmente cualquier diana. Sin embargo, las inmunoglobulinas tienen limitaciones que se basan principalmente en sus propiedades biofísicas generales y su estructura molecular bastante complicada. Por tanto, ya en la década de 1990 varios grupos de investigación han explorado proteínas globulares pequeñas como sustitutos para los anticuerpos. La idea detrás de este concepto es la transferencia de un sitio de unión universal desde una estructura de anticuerpo a marcos proteicos alternativos, los denominados andamiajes. Hasta ahora se han descrito más de 40 andamiajes, entre ellos dos dominios SH3, los dominios SH3 de las quinasas Abl y Src (véase Binz et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 10, 1257-1268, 2005).

Los dominios SH3 se encuentran en muchas proteínas diferentes implicadas en la señalización intracelular y organización citoesquelética (Cohén et al., "Modular binding domains in signal transduction proteins". Cell 80(2): 237- 48, 1995). A pesar de la variabilidad en sus estructuras primarias estos dominios SH3 comparten un estructura global muy similar y un modo de unión a proteínas que comparten la secuencia consenso mínima PxxP que es un determinante crítico para unión a SH3 natural. Una función importante de los dominios SH3 es participar en interacciones proteína-proteína muy selectivas.

El documento EP 1541694 A1 describe un método de identificar, seleccionar y/o caracterizar un compuesto que modula la actividad de al menos una quinasa de la familia Src. Se refiere además a compuestos identificados por dicho método, composiciones farmacéuticas y el uso de esos compuestos y composiciones farmacéuticas en el tratamiento de enfermedades, que están causadas al menos en parte por una quinasa de la familia Src.

El documento US 6.326.469 B1 se refiere a tirosinas quinasas citoplásmicas aisladas de megacarlocltos (megacariocito quinasas o MKK) que están implicadas en rutas de transducción de señal celular y al uso de estas proteínas en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. La patente en EE UU se refiere además a megacariocito quinasas específicas, designadas MKK1, MKK2 y MKK3, y su uso como agentes terapéuticos y diagnósticos.

Erpel et al. ("Mutational analysis of the Src SH3 domain: the same residues of the ligand binding surface are important for intra- and intermolecular interactions". Embo J. 14(5): 963-75,1995) investigaron la Influencia de mutaciones en los bucles RT y n-Src de dominios SH3 de Src y demostraron que mutaciones en ambos bucles que están adyacentes a la superficie hidrofóbica podían influir la capacidad de este dominio para participar en asociaciones Ínter- e intramoleculares.

Hiipakka et al. ("SH3 domains with high affinity and engineered ligand speclficltles targeted to HIV-1 Nef. J. Mol. Biol. 293(5): 1097-106, 1999) investigaron la capacidad del bucle RT del dominio SH3 de Hck para actuar como un determinante de especificidad y afinidad versátil. Los autores construyeron una biblioteca en fagos de dominios de Hck, donde 6 aminoácidos del bucle RT se aleatorizaron (llamada RRT-SH3). Usando esta estrategia identificaron dominios RRT-SH3 individuales que se pueden unir a Nef de VIH-1 hasta 40 veces mejor que Hck-Sh3. Los autores indican la importancia del bucle RT en la selección de ligando de SH3 como una estrategia general para crear dominios SH3 con propiedades de unión deseadas.

Lee et al. ("A single amino acid in the SH3 domain of Hck determines its high affinity and specificity in binding to HIV- 1 Nef protein". Embo. J. 14(20): 5006-15, 1995) investigaron la base estructural de las diferentes afinidades y especificidades de unión de SH3 de Hck a la proteína Nef de VIH-1 y fueron capaces de transferir la propiedad de

unión de SH3 de Hck hacia Nef al dominio SH3 de Fyn mediante una única mutación en el bucle RT del dominó

SH3 de Fyn (R96I).

Hosse et al. ("A new generatlon of proteln display scaffolds for molecular recognltlon", Proteln Science, 15: 14-27, 2006) específicamente aborda los requisitos para proteínas de unión adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Los autores indican la importancia de algunas características para proteínas de unión terapéuticamente útiles tal como estabilidad en suero, penetración de tejido, depuración en sangre, retención de diana y respuesta inmunitaria. En el último respecto se indica que las proteínas terapéuticas no humanas se deben hacer tan similares a sus equivalentes humanos como sea posible y un andamiaje humano podría menos inmunógeno desde el principio. Estos autores concluyen:

"Sin embargo, incluso un andamiaje enteramente humano no es garantía de que una proteína no provoque una respuesta inmunitaria humana, especialmente si es una proteína intracelular. La aleatoriación de aminoácidos durante la construcción de la biblioteca puede potencialmente introducir epítopos de células T novedosos. Incluso mutaciones puntuales únicas pueden dar una proteína humana inmunógena. Además, la mayoría de los andamiajes humanos causan alguna respuesta autoinmunitaria".

Hoy, los dominios SH3 de las quinasas Abl y Hck se reconocen como andamiajes proteicos para generar unidores de proteína con especificidad prescrita, incluso aunque solo se han identificado unidores hacia ligandos conocidos como las proteínas Nef o péptidos sintéticos hasta ahora (Véase Binz et al., anteriormente).

El dominio SH3 de la quinasa Fyn (Fyn SH3) comprende 63 residuos (aa 83-145 de la secuencia descrita por Semba et al. ("yes-related protooncogene, syn, belongs to the protein-tyrosine kinase family". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83(15): 5459-63, 1986) y Kawakami et al. ("Isolation and oncogenic potential of a novel human src-like gene". Mol Cell Biol. 6(12): 4195-201, 1986). Fyn es un miembro de 59 kDa de la familia Src de tirosinas quinasas. Como resultado de ayuste alternativo la proteína Fyn existe en dos isoformas diferentes que se diferencian en sus dominios quinasa; una forma se encuentra en timocitos, esplenocitos y algunas líneas celulares hematolinlbides, mientras que una segunda forma se acumula principalmente en cerebro (Cookey Perlmutter, "Expression of a novel form of the Fyn proto-oncogene in hematopoietic cells". New Biol. 1(1): 66-74, 1989). Las funciones biológicas de Fyn son diversas e incluyen señalización a través del receptor de células T, regulación de la función cerebral así como señalización mediada por adhesión (Resh, M. D. "Fyn, a Src family tyrosine kinase". Int. J. Biochem. Cell Biol. 30(11): 1159-62, 1998). Es una proteína intracelular. SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de SH3 de Fyn (aa 83-145 de la quinasa Fyn como describieron Kawakami et al., y Semba et al., en 1986, véase anteriormente):

GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGPWWEARSLTTGETGYIPSNY VAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1)

La secuencia del bucle RT-Src y el n-Src están subrayada y doble subrayada, respectivamente.

La secuencia de aminoácidos de SH3 de Fyn está completamente conservada entre el hombre, ratón, rata y mono (gibón). El SH3 de Fyn de pollo se diferencia en... [Seguir leyendo]

Una proteína de unión recombinante que tiene una afinidad de unión específica a una proteína o péptido, en donde dicha proteína o péptido no es un ligando de unión a SH3 natural, que comprende al menos un derivado del dominio de homología 3 de Src (SH3) de la quinasa FYN, en donde

(a) al menos un aminoácido en o localizado hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle src y

(b) al menos un aminoácido en o localizado hasta dos aminoácidos adyacentes al bucle RT,

se sustituyen, delecionan o añaden, en donde el derivado del dominio SH3 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y en donde dicho derivado del dominio SH3 tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que representa el dominio de homología 3 de Src (SH3) de la quinasa FYN fuera de los bucles src y RT y con la condición de que la proteína recombinante no sea una proteína que contiene un dominio SH3 natural existente en la naturaleza.

La proteína de unión según la reivindicación 1, que comprende al menos dos derivados del dominio SH3, preferiblemente una proteína de unión bivalente.

La proteína de unión según las reivindicaciones 1 o 2, que comprende uno o preferiblemente dos residuos alterados en las posiciones 37 y/o 50 del derivado del dominio SH3, preferiblemente dos residuos alterados hidrofóbicos, más preferiblemente Trp37 y/o Tyr50, siendo lo más preferido Trp37 y Tyr50.

La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que tiene una afinidad de unión específica de 10'7 a 10'12 M, preferiblemente de 10"8 a 10"12 M, al dominio extracelular de fibronectina oncofetal (ED-B).

La proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Una proteína de fusión que comprende una proteína de unión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 fusionada a un componente farmacéuticamente y/o diagnósticamente activo.

La proteína de fusión según la reivindicación 6, en donde dicho componente se selecciona del grupo que

consiste en:

(i) citoquinas, preferiblemente citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en IL-2, IL-12, TNF-alfa, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF beta, LT-beta, ligando CD-40, ligando Fas, TGF-beta, IL-1 alfa e IL-1 beta;

(¡i) compuestos tóxicos, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños o polipéptidos, preferiblemente compuestos tóxicos seleccionados del grupo que consiste en caliqueamicina, neocarcinostatina, esperamicina, dinemicina, kedarcidina, maduropeptina, doxorubicina, daunorubicina, auristatina, cadena A de Ricina, modeccina, exotoxina A de Pseudomonas truncada, toxina de la difteria y gelonina recombinante

(i¡¡) quimioquinas, preferiblemente quimioquinas seleccionadas del grupo que consiste en IL-8, GRO alfa, GRO beta, GRO gamma, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 alfa/beta, BUNZO/STRC33, l-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1alfa, MIP-1 beta, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, FICC-4, DC-CK1, MIP-3 alfa, MIP-3 beta, MCP-1-5, Eotaxina, Eotaxina-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, Linfotactina y Fractalquina;

(iv) colorantes fluorescentes, preferiblemente un componente seleccionado de los colorantes Alexa Fluor o

Cy;

(v) fotosensibilizadores, preferiblemente bis(trietanolamina)Sn(IV) clorinae6 (SnChe6);

(vi) factores procoagulantes, preferiblemente factores tisulares;

(vii) enzimas para la activación de profármacos, preferiblemente enzimas seleccionadas del grupo que consiste en carboxipeptidasas, glucuronidasas y glucosidasas;

(vii) radionúclidos bien del grupo de emisores gamma, preferiblemente 99mTc, 1231, 1111, o del grupo de emisores de positrones, preferiblemente 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 1241, o del grupo de emisores beta, preferiblemente 1311, 90Y, 177Lu, 67Cu, o del grupo de emisores alfa, preferiblemente 213Bi, 211 At; y

(viii) dominios Fe funcionales, preferiblemente dominios Fe funcionales humanos.

La proteína de fusión según la reivindicación 6 o 7, que comprende además un componente que modula la semivida en suero, preferiblemente un componente seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), inmunoglobulina y péptidos que se unen a albúmina.

La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende la proteína de unión según la reivindicación 5 o 6.