Un procedimiento para la purificación continua o casi continua de una mezcla (F) de múltiples componentes por medio de al menos dos columnas cromatográficas individuales a través de las cuales se suministra una mezcla por medio de al menos un disolvente (s),

en el que la mezcla (F) de múltiples componentes comprende al menos impurezas ligeras (A), un producto intermedio (B) que ha de ser purificado e impurezas pesadas (C), en el que las columnas son operadas en al menos una posición de un modo por lotes, en el cual la salida de una columna se usa para recoger el producto intermedio (B), así como en al menos una posición de un modo continuo o casi continuo, en el cual, en este modo, la salida de al menos una columna está conectada en comunicación de fluidos con la entrada de al menos otra columna, en el que dicho modo por lotes y dicho modo continuo o casi continuo se llevan a cabo o bien de manera sincrónica o secuencialmente, en el que, después de un tiempo (t*) de conmutación, o dentro del mismo, las columnas se desplazan en sus posiciones en una dirección contraria a la dirección general del flujo del disolvente, en el que las columnas se agrupan en al menos cuatro secciones (α, ß y , δ) que consisten en una o varias columnas cromatográficas, y en las que una primera sección (α) está dotada de al menos una entrada del disolvente (s) y al menos una salida para el producto intermedio (B) purificado, de modo que saca por lavado el producto intermedio (B) del sistema, pero mantiene las impurezas pesadas (C) dentro de la sección (α), una segunda sección (ß) está dotada de al menos una entrada del disolvente (s) y al menos una salida conectada a una entrada de una cuarta sección (δ), de modo que lava el producto intermedio (B), que está contaminado con impurezas pesadas (C) y lo introduce en la cuarta sección (δ) a través de dicha salida, pero mantiene las impurezas pesadas (C) puras dentro de la segunda sección (ß), una tercera sección (γ) está dotada de al menos una entrada del disolvente (s) y una salida para impurezas pesadas (C), de modo que saca por lavado las impurezas pesadas (C) a través de dicha salida y limpia la o las columnas cromatográficas, la cuarta sección (δ) está dotada de al menos una entrada para recibir la producción de la salida de la segunda sección (ß), así como al menos una entrada para suministrar la mezcla (F) de múltiples componentes, y al menos una salida para las impurezas ligeras (A), de modo que saca por lavado las impurezas ligeras (A) del sistema, pero mantiene el producto intermedio (B) dentro de la sección (δ), en el que las funciones de las secciones se llevan a cabo o bien de manera sincrónica o secuencialmente, y en el que después de un tiempo (t*) de conmutación, o dentro del mismo, la última columna de la primera sección (α) se desplaza a la primera posición de la segunda sección (ß), la última columna de la segunda sección (ß) se desplaza a la primera posición de la tercera sección (γ), la última columna de la tercera sección (γ) se desplaza a la primera posición de la cuarta sección (δ) y la última columna de la cuarta sección (δ) se desplaza para convertirse en la primera columna de la primera sección (α), en el que si los agrupamientos de las secciones (α; ß; γ;δ / δg, δf, δr) se realizan por columnas únicas, las funciones de las secciones individuales (α; ß; γ; δ / δg, δf, δr) se cumplen secuencialmente con etapas alternantes de elución continua o casi continua y con etapas con elución en lotes dentro de un tiempo (t*) de conmutación

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere al campo de los procedimientos de purificación en múltiples columnas y con sus optimizaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La cromatografía por lotes es bien conocida y se aplica de forma rutinaria y preparatoria en las producciones industriales. Sin embargo, la técnica es bastante costosa, en particular para la separación y la purificación a gran escala, debido al elevado consumo de disolvente y al caro material de la columna, y requiere un uso óptimo del equipo cromatográfico para que resulte rentable.

Para las separaciones a gran escala en producciones reales, los procedimientos continuos son mucho más económicos que los procedimientos por lotes. Las ventajas de un procedimiento continuo son, por ejemplo, un rendimiento elevado, menor consumo de disolvente (recuperación), fraccionamiento y análisis menos costosos, mayor flexibilidad para las cantidades que han de ser purificadas, etc.

Una manera de llevar a cabo un procedimiento cromatográfico continuo es el denominado procedimiento de lecho móvil simulado (SMB; para una reseña, véase, por ejemplo, Markus Juza, Marco Mazzotti y Massimo Morbidelli, Simulated moving-bed chromatography and its application to chirotechnology, Trends in biotechnology, Elsevier B.V., TIBTECH, marzo de 2000, Vol. 18, pp. 108-118). Este procedimiento puede separar una mezcla en dos fracciones ajustando dos corrientes de entrada (suministro, eluyente) y dos corrientes de salida (refinado, extracto). El procedimiento de SMB es a contracorriente, de modo que es posible una separación bien definida de las dos fracciones con rendimientos elevados. Ejemplos típicos de la técnica de SMB en la industria son las separaciones quirales, en las que se separan dos enantiómeros de una mezcla racémica. Si las selectividades son muy pequeñas, normalmente un procedimiento en lotes da como resultado rendimientos mucho menores, mientras que, sin embargo, el SMB permite tener una pureza elevada y rendimientos elevados.

Se han propuesto diversas modificaciones del procedimiento de SMB para optimizarlo y adaptarlo a problemas específicos. Así, por ejemplo, se ha propuesto variar los instantes de conexión y desconexión individuales de las corrientes de entrada y las corrientes de salida; es decir, las corrientes de entrada y las corrientes de salida no se conmutan de forma concomitante como en el SMB clásico, sino según un plan específico y en etapas (lo que se denomina técnica Varicol; véase, por ejemplo, el documento WO-A2004/039468).

Otra variación ha sido propuesta por Morbidelli et al (véase, por ejemplo, “PowerFeed operation of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval” de Ziyang Zhang, Marco Mazzotti, Massimo Morbidelli, Journal of Chromatography A, 1006 (2003) 87-99, Elsevier B.V.), en la que, para compensar la variación temporal en la concentración de la producción del extracto y el refinado debido a la conmutación diferenciada después de cada tiempo de ciclo, se varía el caudal del eluyente de manera compensatoria coordinada con el intervalo de conmutación, permitiendo que haya una pureza aún mayor (lo que se denomina técnica de suministro potenciado).

Se ha propuesto una tercera variación, casi análoga, en la que se varía no el caudal del eluyente, sino la concentración del suministro de una manera compensatoria para lograr el mismo objetivo (lo que se denomina técnica Modicon; véase, por ejemplo, el documento WO 2004/014511).

Como ya se ha mencionado, en particular, la cromatografía a gran escala es una técnica laboriosa y cara. Es útil únicamente para la separación a gran escala de moléculas valiosas. Las moléculas más valiosas del mercado son las biomoléculas, como, por ejemplo, los péptidos, las proteínas y los anticuerpos. Normalmente, estas moléculas son purificadas por medio de la cromatografía en lotes con gradiente de disolvente. A diferencia del término “separación”, que en el contexto de estas aplicaciones significará la separación de una mezcla en dos fracciones, “purificación” significa que el producto deseado es un intermedio entre impurezas de adsorción ligeras y pesadas, y que se generan tres fracciones. Un ciclo de SMB solo puede separar la corriente de suministro en dos fracciones (separación), pero para las purificaciones se requieren tres fracciones, estando el componente deseado en la fracción intermedia. Se requeriría un SMB de dos etapas o secuencial para purificar una mezcla de múltiples componentes como una biomolécula intermedia deseada e impurezas pesadas y ligeras con el problema, sin embargo, de que si, por ejemplo, en una primera etapa del SMB se generan un primer refinado y un primer extracto y en la segunda etapa del SMB el primer extracto es separado en un segundo refinado (producto deseado) y un segundo extracto, todos los constituyentes no deseados que deberían haber sido separados en la primera etapa (y que debería haber acabado en el primer refinado) acabarán, ciertamente, en el segundo refinado, lo que, en particular para concentraciones bajas de la fracción deseada, hace inútil tales procedimientos.

Aparte de lo anterior, también se aplicaron otras variaciones modificadoras del modelo de SMB, como, por ejemplo, durante algunos años los procedimientos de SMB vienen operándose también en lo que se denomina “modo de gradiente de disolvente” (véase, por ejemplo, el documento US 4.031.155). El significado de este “gradiente de disolvente” es que el SMB contiene secciones, que operan con diferentes niveles de modificador. Este tipo de gradiente es un “gradiente escalonado”. Sin embargo, para la purificación de biomoléculas, se desearía un gradiente lineal homogéneo, tal como se aplica de manera rutinaria en las purificaciones por lotes con un gradiente (lineal) de disolvente.

El documento EP-A-0495640 da a conocer un procedimiento y un aparato para separar de manera continua una mezcla de múltiples componentes que contiene al menos 3 componentes y purificar cada componente con una concentración elevada, una pureza elevada y una recuperación elevada, en el que el aparato comprende un grupo de columnas que comprende una zona de fraccionamiento, una zona de purificación y una zona de desorción que se forman combinando al menos 2 columnas para formar un subgrupo y combinando al menos 3 zonas; tuberías de conexión de subgrupos para conectar en serie las columnas en la zona de fraccionamiento; tuberías de conexión de subgrupos para conectar columnas correspondiente de dos subgrupos situadas en la zona de separación (en serie) y la zona de purificación (en paralelo); tuberías de conexión de zonas para conectar en paralelo cada columna de la zona de fraccionamiento y cada columna de la zona de purificación; tuberías de purificación/desorción de suministro del medio para suministrar cada medio de purificación/desorción a cada columna de las zonas de purificación y desorción; un medio de suministra de la mezcla objeto para suministra una mezcla de múltiples componentes a la columna de la corriente más superior de la zona de fraccionamiento; y un medio de desplazamiento de grupos de columnas para desplazar sucesivamente las columnas de la subzona presente a la subzona siguiente y/o un medio de conmutación para conmutar el flujo de las tuberías entre columnas mediante la apertura o el cierre de válvulas. Las columnas en este procedimiento siempre se conmutan como grupos completos. Además, dentro de la zona denominada desorción, la totalidad de los productos A, B, C se saca del sistema por lavado.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado de purificación que permite separar tres fracciones. El procedimiento será simple de configurar, en particular teniendo en cuenta aplicaciones a gran escala, y permitirá una pureza elevada y un rendimiento elevado. Se propone un procedimiento para la purificación continua o casi continua de una mezcla de múltiples componentes por medio de columnas cromatográficas individuales a través de las cuales se suministra la mezcla por medio de al menos un disolvente. La meta del procedimiento no es simplemente la separación de dos fracciones, sino que la principal ventaja es que puede purificarse una verdadera mezcla de múltiples componentes que, al menos, comprende impurezas ligeras, un producto intermedio que ha de ser purificado e impurezas pesadas; es decir, puede aislarse un producto intermedio, y esto aunque este producto... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la purificación continua o casi continua de una mezcla (F) de múltiples componentes por medio de al menos dos columnas cromatográficas individuales a través de las cuales se suministra una mezcla por medio de al menos un disolvente (s), en el que la mezcla (F) de múltiples componentes comprende al menos impurezas ligeras (A), un producto intermedio (B) que ha de ser purificado e impurezas pesadas (C),

en el que las columnas son operadas

en al menos una posición de un modo por lotes, en el cual la salida de una columna se usa para recoger el producto intermedio (B), así como

en al menos una posición de un modo continuo o casi continuo, en el cual, en este modo, la salida de al menos una columna está conectada en comunicación de fluidos con la entrada de al menos otra columna,

en el que dicho modo por lotes y dicho modo continuo o casi continuo se llevan a cabo o bien de manera sincrónica o secuencialmente,

en el que, después de un tiempo (t*) de conmutación, o dentro del mismo, las columnas se desplazan en sus posiciones en una dirección contraria a la dirección general del flujo del disolvente, en el que las columnas se agrupan en al menos cuatro secciones (α, β, γ, δ) que consisten en una o varias columnas cromatográficas, y en las que

una primera sección (α) está dotada de al menos una entrada del disolvente (s) y al menos una salida para el producto intermedio (B) purificado, de modo que saca por lavado el producto intermedio (B) del sistema, pero mantiene las impurezas pesadas (C) dentro de la sección (α),

una segunda sección (β) está dotada de al menos una entrada del disolvente (s) y al menos una salida conectada a una entrada de una cuarta sección (δ), de modo que lava el producto intermedio (B), que está contaminado con impurezas pesadas (C) y lo introduce en la cuarta sección (δ) a través de dicha salida, pero mantiene las impurezas pesadas (C) puras dentro de la segunda sección (β),

una tercera sección (γ) está dotada de al menos una entrada del disolvente (s) y una salida para impurezas pesadas (C), de modo que saca por lavado las impurezas pesadas (C) a través de dicha salida y limpia la o las columnas cromatográficas,

la cuarta sección (δ) está dotada de al menos una entrada para recibir la producción de la salida de la segunda sección (β), así como al menos una entrada para suministrar la mezcla (F) de múltiples componentes, y al menos una salida para las impurezas ligeras (A), de modo que saca por lavado las impurezas ligeras (A) del sistema, pero mantiene el producto intermedio (B) dentro de la sección (δ), en el que las funciones de las secciones se llevan a cabo o bien de manera sincrónica o secuencialmente, y

en el que después de un tiempo (t*) de conmutación, o dentro del mismo,

la última columna de la primera sección (α) se desplaza a la primera posición de la segunda sección (β), la última columna de la segunda sección (β) se desplaza a la primera posición de la tercera sección (γ), la última columna de la tercera sección (γ) se desplaza a la primera posición de la cuarta sección (δ) y la última columna de la cuarta sección (δ) se desplaza para convertirse en la primera columna de la primera sección (α),

en el que si los agrupamientos de las secciones (α; β; γ; δ / δg, δf, δr) se realizan por columnas únicas, las funciones de las secciones individuales (α; β; γ; δ / δg, δf, δr) se cumplen secuencialmente con etapas alternantes de elución continua o casi continua y con etapas con elución en lotes dentro de un tiempo (t*) de conmutación.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que para la purificación continua o casi continua de la mezcla (F) de múltiples componentes se usan al menos tres columnas cromatográficas individuales a través de las cuales se suministra la mezcla por medio de al menos un disolvente (s).

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2 en el que el disolvente (s) suministrado a al menos una de las secciones (α, β, γ, δ) varía en composición de forma sustancialmente continua durante el tiempo (t*) de conmutación y/o, en caso de un disolvente supercrítico, el disolvente (s) supercrítico suministrado a al menos una de las secciones (α, β, γ, δ) varía en densidad de forma sustancialmente continua durante el tiempo (t*) de conmutación.

4. Un procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes en el que el disolvente (s) suministrado a todas las secciones (α, β, γ, δ) varía en composición de forma sustancialmente continua al aumentar o disminuir la concentración modificadora durante el tiempo (t*) de conmutación y/o, en caso de un disolvente supercrítico, varía en densidad al aumentar o disminuir la densidad durante el tiempo (t*) de conmutación, y en el que junto con la secuencia de las columnas desde la cuarta (δ) a la primera (α) sección, la concentración de modificador (Cmod)/densidad aumenta o disminuye de tal manera que, después de un desplazamiento de las columnas, la concentración de modificador (Cmod)/densidad en cada columna está sustancialmente en la concentración base de modificador/densidad del disolvente supercrítico en la nueva posición de la columna y de tal manera que, durante el siguiente tiempo (t*) de conmutación, la concentración de modificador/densidad dentro de cada columna aumenta o disminuye hasta la concentración base de modificador/densidad de la posición siguiente después de un desplazamiento adicional de las columnas.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4 en el que el disolvente (s) suministra a todas o a algunas secciones (α, β, γ, δ) varía de forma sustancialmente continua de manera lineal o casi lineal o no lineal durante el tiempo (t*) de conmutación en composición y/o densidad, en el que, preferentemente, la concentración de modificador varía de tal manera.

6. Un procedimiento según las reivindicaciones 4 o 5 en el que en cada entrada de disolvente se proporciona disolvente con una concentración base constante individual (Cmod,c) de modificador, y en el que se proporciona una corriente de disolvente de caudal y/o composición cambiantes, preferentemente una concentración cambiante de modificador (Cmod,v), a varias entradas y se mezcla con el disolvente a una concentración base constante individual (Cmod,c) del modificador para establecer el gradiente junto con el sistema.

7. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que al menos una sección (α, β, γ, δ) comprende al menos dos columnas.

8. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la segunda sección (β) comprende al menos dos columnas conectadas de manera secuencial a contracorriente.

9. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que la cuarta sección (δ) comprende al menos tres columnas agrupadas en tres subsecciones (δf, δg, δr), o menos columnas que proporcionan secuencialmente la función de estas subsecciones, en el que la primera subsección (δf) comprende al menos una entrada para suministrar la mezcla (F) de múltiples componentes, preferentemente con un caudal menor que el caudal global del sistema, y al menos una salida o bien para la eliminación directa de impurezas ligeras (A) del sistema o para su introducción en una entrada de la tercera subsección (δr), en el que

la segunda subsección (δg) comprende al menos una entrada para tomar la producción de la segunda sección (β) y al menos una salida conectada a al menos una entrada de la tercera subsección (δr), en el que

la tercera subsección (δr) comprende al menos una entrada para tomar la producción de la segunda subsección (δg) y posiblemente al menos una entrada para tomar la producción de la primera subsección (δr), y al menos una salida,

en el que, después de un tiempo (t*) de conmutación, o dentro del mismo, una columna de la primera subsección (δf) se desplaza a la primera posición de la segunda subsección (δg), la última columna de la segunda subsección (δg) se desplaza a la primera posición de la primera sección (α), la última columna de la tercera sección (γ) se desplaza a la primera posición de la tercera subsección (δr) y la última columna de la tercera subsección (δr) se desplaza para convertirse en una columna de la primera subsección (δf),

y en el que las funciones de las secciones (δf, δg, δr) se cumplen o bien de manera sincrónica o secuencialmente.

10. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el sistema comprende tres columnas, en el que las funciones de las secciones primera (α), segunda (β) y tercera (γ) son realizadas por una única columna, y en el que, dentro de un tiempo de conmutación, esta única columna

en primer lugar toma una función de la primera sección (α), porque está dotada de una entrada para disolvente y porque su salida se usa para recoger el producto intermedio (B), mientras que las columnas que proporcionan la función de la cuarta sección (δ) están conectadas en serie y mientras que, por medio de la salida de la cuarta sección (δ), se recogen las impurezas ligeras (A),

de forma subsiguiente esta única columna toma la función de la segunda sección (β), porque está dotada de una entrada para disolvente y porque su salida está directamente conectada a la primera columna de la cuarta sección (δ), mientras que las columnas que proporcionan la función de la cuarta sección (δ) están conectadas en serie y mientras que, por medio de la salida de la cuarta sección (δ), se recogen las impurezas ligeras (A), y

de forma subsiguiente esta única columna toma la función de la tercera sección (γ), porque está dotada de una entrada para disolvente y porque su salida se usa para recoger las impurezas pesadas (C), mientras que las columnas que proporcionan la función de la cuarta sección (δ) están conectadas en serie, mientras que, por medio de la salida de la cuarta sección (δ), se recogen las impurezas ligeras (A) y mientras que, entre las columnas que proporcionan la función de la cuarta sección (δ), se suministra la mezcla (F) de múltiples componentes a la cuarta sección (δ).

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que se combinan pares de funciones secuenciales de las secciones (α; β; γ; δ / δg, δf, δr) dentro de una columna y en el que, dentro de un tiempo de conmutación, se alternan etapas de elución continua o casi continua y etapas con elución en lotes, que cumplen esas funciones de manera secuencial.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11 en el que la cuarta sección (δ) comprende tres subsecciones (δf, δg, δr) según la reivindicación 10, y en el que se proporcionan tres columnas en el sistema completo, estando conectadas secuencialmente estas tres columnas en una etapa (CCL) de elución continua o casi continua dentro de una primera fracción de un tiempo de conmutación, y estando accionadas en una etapa de lotes (BL) para sacar fracciones individuales (A, B, C) de la mezcla (F) de múltiples componentes dentro de una segunda fracción del tiempo de conmutación.

13. Un procedimiento según la reivindicación 11 en el que la cuarta sección (δ) comprende tres subsecciones (δf, δg, δr) según la reivindicación 10, y en el que se proporcionan cuatro columnas en el sistema completo, estando conectadas secuencialmente estas cuatro columnas en una etapa

(CCL) de elución continua o casi continua dentro de una primera fracción de un tiempo de conmutación, y estando accionadas en una etapa de lotes (BL) para sacar fracciones individuales (A, B, C) de la mezcla (F) de múltiples componentes dentro de una segunda fracción del tiempo de conmutación, en el que en esta etapa de lotes (BL) una de las columnas tiene un caudal cercano o igual a cero.

14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 en el que el sistema comprende dos columnas, en el que la cuarta sección (δ) comprende tres subsecciones (δf, δg, δr) según la reivindicación 10, en el que las dos columnas están

en una primera parte del tiempo de conmutación conectadas en serie para la elución continua mientras que, por medio de la salida, se recogen impurezas ligeras (A), en el que

en una segunda parte del tiempo de conmutación las columnas están accionadas en modo de lotes para recoger la fracción intermedia (B) en la columna corriente arriba e impurezas ligeras (A) en la columna corriente abajo mientras que, a la vez, se suministra la mezcla (F) de múltiples componentes a la columna corriente abajo, en el que

en una tercera parte del tiempo de conmutación las columnas están conectadas en serie para la elución continua mientras que, por medio de la salida, se recogen impurezas ligeras (A), y en el que

en una cuarta parte del tiempo de conmutación las columnas están accionadas en modo de lotes para recoger las impurezas pesadas (C) en la columna corriente arriba e impurezas ligeras (A) en la columna corriente abajo,

en el que, después de cada tiempo de conmutación, se intercambian las posiciones de las dos columnas.

15. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 14 en el que la primera subsección (δf) comprende al menos dos columnas paralelas, y/o en el que las subsecciones segunda (δg) y/o tercera (δr) comprenden al menos dos columnas paralelas o secuenciales a contracorriente.

16. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que el suministro es continuo, a impulsos o con un perfil formado de concentración/densidad dentro de un tiempo (t*) de conmutación y/o en el que los flujos de disolventes varían dentro de un tiempo (t*) de conmutación y/o en el que la conmutación de las entradas/salidas individuales está escalonada dentro de un tiempo (t*) de conmutación.

17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que es diferente el caudal en las columnas individuales.

18. Un procedimiento para establecer los parámetros para ejecutar un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que en una primera etapa se realiza un cromatograma de gradiente en lotes, en una segunda etapa el cromatograma obtenido es dividido en una primera parte con la fracción ligera, una segunda parte con la fracción deseada, una tercera parte con la

5 fracción deseada solapada con la fracción pesada, y una cuarta parte únicamente con la fracción pesada, y en el que en una tercera etapa se escogen los parámetros del procedimiento, de tal modo que la primera sección (α) cumple la tarea del cromatograma de gradiente en lotes en el tiempo de la segunda parte, que la segunda sección (β) cumple la tarea del cromatograma de gradiente en lotes en el tiempo de la tercera parte, que la tercera sección (γ) cumple la tarea del cromatograma de gradiente en lotes en el tiempo de la cuarta parte, y que la cuarta sección (δ) cumple la tarea del cromatograma de gradiente en lotes en el tiempo de la primera parte.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que el tiempo (t*) de conmutación se calcula como el tiempo hasta que la fracción deseada empieza a eluirse con la pureza deseada multiplicado por el caudal (Qlote) del cromatograma de gradiente en lotes dividido por el caudal máximo (Qmáx) de la configuración y dividido por el número (N) de columnas de la cuarta sección (δ) que ejecutan esa parte del gradiente.

20. Un procedimiento según las reivindicaciones 18 o 19 en el que el caudal en cada columna se determina en base al tiempo que lleva la parte correspondiente en el cromatograma de gradiente en lotes multiplicado por el caudal por lotes (Qlote) dividido por el tiempo (t*) de conmutación.