Proceso para preparación de FGF-21 con grado de O-glicosilación bajo.

Un proceso para expresión recombinante de FGF21 nativo con SEQ ID NO:

1 y análogos del mismo, pudiendo deducirse o derivarse dichos análogos de FGF21 humano nativo con SEQ ID NO:1 por modificación de la secuencia de aminoácidos, siendo dicha modificación sustitución, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos, teniendo dichos análogos un efecto de disminución de glucosa y teniendo una identidad con FGF21 humano que es al menos 95%, en donde la levadura utilizada es una cepa de pmt2 desactivada.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/050718.

Solicitante: NOVO NORDISK A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Novo Allé 2880 Bagsværd DINAMARCA.

Inventor/es: SLAABY,RITA, LAUTRUP-LARSEN,INGER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/50 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).
  • C12P21/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).

PDF original: ES-2543634_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Proceso para preparación de FGF-21 con grado de O-glicosilación bajo Campo de esta invención Esta invención se refiere a un proceso especial para preparación del Factor de Crecimiento de los Fibroblastos 21 (FGF21) y análogos del mismo, y aspectos estrechamente relacionados con el mismo.

Antecedentes de esta invención Los factores de crecimiento de los fibroblastos son polipéptidos expresados en tejidos en desarrollo y adultos. Los mismos están implicados en varios mecanismos fisiológicos que incluyen, por ejemplo, la regulación del metabolismo y la diferenciación celular. Existe una familia completa de más de 20 factores de crecimiento de los fibroblastos (la familia FGF) . Tres miembros de la familia FGF, que incluyen FGF19, FGF21, y FGF23 forman una sub-familia que funcionan como factores endocrinos implicados en la regulación metabólica.

El Factor de Crecimiento de los Fibroblastos 21 o FGF-21, en esta memoria para abreviación FGF21, se expresa preferentemente en el hígado y se ha demostrado que ejerce efectos metabólicos de tipo hormona.

Durante décadas, ha sido posible preparar una extensa gama de péptidos y proteínas recombinantemente, por ejemplo en una bacteria tal como Escherichia coli o en levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae. Las proteínas expresadas en levadura están a menudo O-glicosiladas. En las proteínas farmacéuticas, debe evitarse usualmente la O-glicosilación. Por ejemplo, el FGF21 humano está fuertemente O-glicosilado cuando se prepara recombinantemente en levadura.

Muteínas de FGF21 que están mutadas en varias posiciones en su secuencia y que tienen capacidad reducida para O-glicosilación cuando se expresan en levadura se dan a conocer en WO 2006/028595A2. WO 2009/105357A1 se refiere a células hospedadoras modificadas para producción de glicoproteínas recombinantes que tienen O30 glicosilación reducida por deleción de varios genes, con inclusión de genes PMT. La reivindicación 1 en US 2002/0068325 se refiere a un método de producción de una proteína heteróloga en hongos que comprende: proporcionar una célula fúngica receptora en la que el mecanismo de control de calidad en dicha célula está modificado de tal modo que las proteínas heterólogas plegadas incompletamente no son degradadas en el retículo endoplásmico; e introducir en dicha célula fúngica receptora un constructo de expresión polinucleotídico. Conforme a la reivindicación 8 de dicho documento, la célula receptora está modificada en el gen de manosil-transferasa que comprende un gen seleccionado del grupo constituido por PMT1, PMT2, PMT3, PMT4, PMT5 and PMT6. En dicha solicitud de patente US no se hace referencia a FGF.

Objetos de esta invención El objeto esta invención es resolver o mejorar al menos una de las desventajas de la técnica anterior, o proporcionar una alternativa útil.

Otro aspecto de esta invención se refiere a la facilitación de un proceso para preparación eficaz de FGF21 y 45 análogos del mismo.

Otro aspecto de la invención se refiere a la facilitación de un proceso recombinante para preparación de FGF21 y análogos del mismo que tienen un grado de O-glicosilación bajo o que carecen totalmente de O-glicosilación.

Otro aspecto de esta invención se refiere a la facilitación de un proceso recombinante en el cual la degradación de FGF21 y sus análogos se reduce.

Definiciones 55 La secuencia de la proteína FGF21 humana nativa está disponible de la base de datos UNIPROT con el número de acceso Q9NSA1, y es como sigue: MDSDETGFEHSGLWVSVLAG-LLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQL-KALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK

QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK-SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS. La proteína precursora de 209 aminoácidos incluye un péptido señal (aminoácidos 1-28) y una proteína madura (aminoácidos 29-209) . La proteína humana madura se incluye en esta memoria como SEQ ID NO:1 (aminoácidos 1-181) , y el péptido señal como SEQ ID NO:2 (aminoácidos 1-28) .

El término "análogo" como se hace referencia al mismo en esta memoria en el contexto de FGF21, es decir, un análogo de FGF21, se refiere a un polipéptido que se deduce o puede deducirse o derivarse de FGF21 humano nativo, en particular de SEQ ID NO:1, por modificación de la secuencia de aminoácidos de la misma. Dicha modificación, enmienda o cambio puede incluir sustitución, deleción, y/o adición de uno o más aminoácidos. En total, preferiblemente se sustituyen, delecionan y/o añaden no más de 8, más preferiblemente no más de 6 aminoácidos. Por ejemplo, pueden añadirse y/o delecionarse aminoácidos en el término C, en el término N, o internamente en la secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, se añaden y/o se delecionan aminoácidos en el término C y/o N, más preferiblemente en el término N. A las secuencias aminoácidos con aminoácidos delecionados terminalmente en C o N puede hacerse referencia también como secuencias truncadas, como es conocido en la técnica. Análogamente, puede hacerse referencia a los aminoácidos añadidos internamente en la secuencia como inserciones. El término análogo de FGF21 se refiere a compuestos que tienen efecto de disminución de la glucosa. El efecto de disminución de la glucosa puede determinarse como se describe en WO 2010/0841169, refiriéndose especialmente el ejemplo 8 a un ensayo de potencia para absorción de glucosa en adipocitos 3T3-L1. Dichos análogos de FGF21 tienen una identidad con FGF21 humana que es al menos 95%. La identidad puede determinarse como se describe en WO 2010/084169, especialmente en las páginas 10 y 11. En esta memoria, el término "PMT" (Proteína Manosil-Transferasa) abarca enzimas que fijan la primera manosa en residuos serina o treonina en las proteínas, conduciendo a un árbol de O-glicosilación de manosa. Sin embargo, no son todos los residuos serina y treonina los que están O-glicosilados en una proteína. Existen al menos 6 enzimas en la familia PMT (Pmtp 1-6) . Las mismas están agrupadas en 3 sub-familias, representándose cada grupo por Pmt1p, Pmt2p o Pmt4p.

En esta memoria, el término "desactivación" abarca la deleción del marco de lectura abierto. La deleción puede ser una deleción del marco de lectura abierto o sustitución del marco de lectura abierto con un marcador. Con un marcador se entienden genes utilizados en genética clásica de levaduras para deleción de genes y sustitución con otro gen cuya actividad puede seleccionarse, tal como TRP1 o KanMX4.

En una realización, todos los aminoácidos y residuos de aminoácido considerados en esta memoria son aminoácidos y residuos de aminoácido que pueden estar codificados por el triplón ("codón") de nucleótidos y, por tanto, los análogos de FCS 21 correspondientes se pueden preparar recombinantemente.

En esta memoria, el término "PMT1" abarca la Proteína-Manosil-Transferasa 1.

En esta memoria, el término "PMT2" abarca la Proteína-Manosil-Transferasa 2.

En esta memoria, el término "PMT4" abarca la Proteína-Manosil-Transferasa 4.

En esta memoria, el término "PEP4" abarca la proteína peptidasa A.

En esta memoria, el término "YPS1" abarca la proteasa aspártica yapsina 1 codificada por YPS1 (denominada también YAP3) .

En esta memoria, el término "MKC7" abarca la aspartil-proteasa 7 enlazada a glicosil-fosfatidilinositol. En esta memoria, el término "TRP1" abarca la fosforribosilantranilato-isomerasa 1.

En esta memoria, el término "kanMX" se utiliza para el gen de Tn903 que confiere resistencia al antibiótico aminoglicosídico G418 de las levaduras transformadas.

En esta memoria, el término "marcador" se utiliza para genes cuya actividad de producto génico puede seleccionarse.

Breve descripción de esta invención Resumidamente, la presente invención es como se describe en las reivindicaciones y cláusulas que siguen.

FGF21 y sus análogos, v.g., los análogos con extensiones de aminoácidos N-terminales, pueden expresarse en Saccharomyces cerevisiae. Estas extensiones de aminoácidos N-terminales pueden estar constituidas por hasta aproximadamente 20 aminoácidos, con preferencia hasta aproximadamente 15 aminoácidos, y siendo la totalidad de los aminoácidos aminoácidos que pueden estar codificados por el triplón, y prepararse recombinantemente. En la presente invención, esto requiere el diseño de una cepa en el cual se crea una cepa desorganizada en PMT2, PEP4 e YPS1. Esta cepa puede diseñarse utilizando técnicas clásicas basadas en recombinación homóloga que permite integración específica en los loci respectivos. FGF21 y sus análogos, v.g., análogos con extensión o mutaciones... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso para expresión recombinante de FGF21 nativo con SEQ ID NO:1 y análogos del mismo, pudiendo deducirse o derivarse dichos análogos de FGF21 humano nativo con SEQ ID NO:1 por modificación de la secuencia de aminoácidos, siendo dicha modificación sustitución, deleción y/o adición de uno o más aminoácidos, teniendo dichos análogos un efecto de disminución de glucosa y teniendo una identidad con FGF21 humano que es al menos 95%, en donde la levadura utilizada es una cepa de pmt2 desactivada.

2. Un proceso conforme a reivindicación 1, en el cual se prepara un análogo de FGF21 con una extensión N10 terminal, estando constituida dicha extensión por hasta aproximadamente 20 aminoácidos.

3. El proceso conforme a reivindicación 1, en el cual la levadura utilizada es Saccharomyces cerevisiae.

4. El proceso conforme a la reivindicación 1 ó 2, en el cual la levadura utilizada es una cepa pep4 desactivada. 15

5. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la levadura utilizada es una cepa yps1 desactivada.

6. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la levadura utilizada es una 20 cepa mkc7 desactivada.

7. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la levadura se cultiva en condiciones en las cuales se expresa la secuencia de DNA exógena y se recupera el FGF21 deseado o un análogo del mismo como se define en la reivindicación 1.

8. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dicho FGF21 se secreta en el medio de cultivo.

9. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la cepa de levadura pmt2 30 desactivada se prepara utilizando el marcador TRP1 o el marcador KanMX4, preferiblemente el marcador TRP1.

10. El proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la ratio entre FGF21 Oglicosilado o un derivado del mismo, por una parte, y FGF21 no O-glicosilado o un análogo del mismo como se define en la reivindicación 1, por otra parte, es inferior a aproximadamente 20%, preferiblemente inferior a aproximadamente 10%, más preferiblemente inferior a aproximadamente 5% e incluso más preferiblemente inferior a aproximadamente 2% (peso/peso) .

11. Un proceso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el análogo de FGF21 preparado ha sido mutado en la posición R17 y/o R36.


 

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