Procedimiento para producir fosfolípido.

Un procedimiento para producir un fosfolípido, comprendiendo el procedimiento:

producir un fosfolípido mediante esterificación de un lisofosfolípido con un donante de acilo por la fosfolipasa A2 en glicerina; y entonces

añadir un disolvente inmiscible con glicerina, formando una capa de glicerina y una capa de disolvente;

extraer el fosfolípido en la capa de disolvente;

transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina; y entonces recoger la capa de glicerina;

retirar el disolvente restante por evaporación de la capa de glicerina, dando una disolución de glicerina;

añadir un lisofosfolípido y un donante de acilo a la disolución de glicerina; y

reesterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disolución de glicerina.

Procedimiento para producir fosfolïpido

Campo tïcnico La presente invenciïn se refiere a procedimientos para producir fosfolïpidos, y en particular se refiere a procedimientos para producir fosfolïpidos mediante fosfolipasa A2.

Antecedentes de la tïcnica Estudios recientes sobre lïpidos han revelado que los ïcidos grasos altamente insaturados tales como ïcido docosahexenoico (DHA) y ïcido eicosapentenoico (EPA) tienen diversas funciones tales como la mejora de la funciïn de aprendizaje, la prevenciïn de arteriosclerosis y la funciïn de mejora del metabolismo lipïdico. En particular, se ha revelado que la toma de DHA en una forma unida a un fosfolïpido tal como fosfatidilcolina proporciona una mayor actividad antioxidante y una mayor estabilidad que las de la forma de triglicïrido, asï como conduce a una buena absorciïn para proporcionar fïcilmente las actividades fisiolïgicas del DHA. Se espera tambiïn que ïcidos grasos funcionales distintos de DHA, tales como EPA, ïcido linoleico conjugado y ïcido araquidïnico, consigan mayores actividades fisiolïgicas por la uniïn a un fosfolïpido.

Los procedimientos para producir un fosfolïpido unido a un ïcido graso funcional tal como DHA se clasifican en un procedimiento de extracciïn de un producto natural y un procedimiento de sïntesis de un material tal como fosfolïpidos de soja. Los ejemplos especïficos del primer procedimiento incluyen un procedimiento de extracciïn de un fosfolïpido unido a DHA de huevas de animales acuïticos como material (documento de patente 1) y un procedimiento de extracciïn de productos marinos tales como un calamar con un disolvente orgïnico (documento de patente 2) . Sin embargo, estos procedimientos no pueden producir fosfolïpidos unidos a ïcidos grasos funcionales distintos de DHA debido a que estos materiales son caros, no pueden suministrarse establemente y la composiciïn de fosfolïpidos depende de los materiales.

Los ejemplos de procedimientos capaces de introducir un ïcido graso deseado no dependiente de la composiciïn del material incluyen un procedimiento de adiciïn de cualquier ïcido graso a una disoluciïn de cultivo de un microorganismo para producir un fosfolïpido unido con el ïcido graso por el microorganismo (documento de patente 3) . Sin embargo, el procedimiento produce el fosfolïpido en una pequeïa cantidad a partir de una gran cantidad de disoluciïn de cultivo, y por tanto la eficacia de producciïn es baja.

Entre los ïltimos procedimientos, los ejemplos de procedimiento de uniïn de DHA a fosfolïpidos de soja y similares incluyen un procedimiento de adiciïn de una sustancia de alta permitividad capaz de formar enlace de hidrïgeno con un sistema de reacciïn de lipasa y fosfolipasa (documento de patente 4) . Sin embargo, el procedimiento puede conseguir una alta velocidad de reacciïn en la reacciïn de un lisofosfolïpido y un ïcido graso por lipasa, pero no puede conseguir una alta velocidad de reacciïn por fosfolipasa A2. Ademïs, es importante para la expresiïn de las actividades fisiolïgicas del fosfolïpido unido a DHA que el DHA estï unido en posiciïn 2, pero un ïcido graso diana se une principalmente a la posiciïn 1 de un fosfolïpido mediante una reacciïn por lipasa, y por lo tanto dicho procedimiento no es muy prïctico.

Al mismo tiempo, como procedimiento para unir eficazmente un ïcido graso deseado con la posiciïn 2 de un fosfolïpido, se han reseïado varios procedimientos de uniïn que usan fosfolipasa A2 en glicerina (documento de patente 5 y documento no de patente 1) . Sin embargo, en estos informes se usa cloroformo-metanol tïxicos para extracciïn despuïs de la reacciïn. Por tanto, el disolvente no puede usarse, dependiendo del uso pretendido del fosfolïpido, o se requiere un aparato para retirar el disolvente. Ademïs, la fosfolipasa A2 es cara, y por ello se requiere dicho procedimiento para reducir costes.

En una reacciïn enzimïtica comïn, se efectïa ampliamente la inmovilizaciïn enzimïtica para un uso eficaz de la enzima. Sin embargo, ha habido informes de que cuando se usa una fosfolipasa A2 inmovilizada en la esterificaciïn por fosfolipasa A2, es improbable que la esterificaciïn proceda eficazmente, incluso cuando se usa un ïcido graso en gran cantidad con respecto a un lisofosfolïpido (documento no de patente 2 y documento no de patente 3) .

Lista de referencias Bibliografïa de patentes Documento de patente 1: JP-A nï 8-59678 Documento de patente 2: JP-A nï 8-325192 Documento de patente 3: JP-A nï 2007-129973 Documento de patente 4: JP-A nï 8-56683 Documento de patente 5: JP-A nï 5-236974

Bibliografïa no de patentes Documento no de patente 1: Fisheries Science, vol. 72, pïginas 909-911 (2006) Documento no de patente 2: Journal of the American Oil Chemists' Society, vol. 72, pïginas 641-646 (1995) Documento no de patente 3: Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1343, pïginas 76-84 (1997)

Sumario de la invenciïn Problema tïcnico Como se describe anteriormente, se demanda desarrollar un procedimiento de recuperaciïn de un fosfolïpido despuïs de una esterificaciïn eficaz por fosfolipasa A2 y de reutilizaciïn de la fosfolipasa A2. Por ello, es un objeto de la presente invenciïn proporcionar un procedimiento para producir un fosfolïpido a bajo coste, mediante reutilizaciïn de fosfolipasa A2, en el procedimiento de producciïn del fosfolïpido unido a cualquier ïcido graso en posiciïn 2’ del fosfolïpido mediante esterificaciïn por fosfolipasa A2 en glicerina.

Soluciïn del problema Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos para resolver los problemas, como resultado, han encontrado que, esterificando un lisofosfolïpido con fosfolipasa A2 en glicerina, extrayendo entonces un fosfolïpido con un disolvente inmiscible con glicerina, retirando entonces el disolvente por evaporaciïn y aïadiendo el lisofosfolïpido y un donante de acilo, puede efectuarse la reesterificaciïn del lisofosfolïpido con el donante de acilo reutilizando la fosfolipasa A2 restante en la glicerina, y se ha logrado la invenciïn.

A saber, la presente invenciïn se refiere a un procedimiento para producir un fosfolïpido caracterizado por incluir producir un fosfolïpido mediante la esterificaciïn de un lisofosfolïpido con un donante de acilo por fosfolipasa A2 en glicerina, aïadir entonces un disolvente inmiscible con glicerina formando una capa de glicerina y una capa de disolvente, extraer el fosfolïpido en la capa de disolvente, transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina y recoger entonces la capa de glicerina, retirar el disolvente restante por evaporaciïn de la capa de glicerina, dando una disoluciïn de glicerina, aïadir el lisofosfolïpido y el donante de acilo a la disoluciïn de glicerina y esterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disoluciïn de glicerina.

En la presente invenciïn, puede aïadirse un disolvente cetona como disolvente inmiscible con glicerina, o puede aïadirse un alcohol que tenga 4 ïtomos de carbono o menos despuïs de la esterificaciïn y aïadirse entonces al menos un disolvente seleccionado del grupo consistente en disolventes hidrocarburos, disolventes cetonas y disolventes ïsteres como disolvente inmiscible con glicerina.

En la presente invenciïn, en la esterificaciïn, puede aïadirse un aminoïcido y/o un pïptido que tenga 3 o menos residuos aminoacïdicos al sistema de reacciïn.

El aminoïcido es preferiblemente al menos uno seleccionado del grupo consistente en glicina, alanina, asparagina, glutamina, isoleucina, leucina, serina, treonina, valina, fenilalanina y tirosina.

El pïptido es preferiblemente una combinaciïn que incluye glicina, alanina y/o serina.

Efectos ventajosos de la invenciïn Segïn la presente invenciïn, puede proporcionarse un procedimiento de producciïn de un fosfolïpido a bajo coste reutilizando la fosfolipasa A2 en el procedimiento de producciïn del fosfolïpido unido a cualquier ïcido graso en la posiciïn 2 del fosfolïpido mediante esterificaciïn por fosfolipasa A2 en glicerina.

Descripciïn de realizaciones De aquï en adelante, la presente invenciïn se describirï con mïs detalle. El procedimiento de producciïn de un fosfolïpido de la presente invenciïn se caracteriza por incluir producir un fosfolïpido mediante esterificaciïn de un lisofosfolïpido con un donante de acilo por fosfolipasa A2 en glicerina, aïadir entonces un disolvente inmiscible con glicerina formando una capa de glicerina y una capa de disolvente, extraer el fosfolïpido en la capa de disolvente, transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina, recoger entonces la capa de glicerina, retirar el disolvente restante por evaporaciïn de la capa de glicerina, dando una disoluciïn... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir un fosfolïpido, comprendiendo el procedimiento:

producir un fosfolïpido mediante esterificaciïn de un lisofosfolïpido con un donante de acilo por la fosfolipasa A2 en glicerina; y entonces aïadir un disolvente inmiscible con glicerina, formando una capa de glicerina y una capa de disolvente; extraer el fosfolïpido en la capa de disolvente; transferir la fosfolipasa A2 a la capa de glicerina; y entonces recoger la capa de glicerina; retirar el disolvente restante por evaporaciïn de la capa de glicerina, dando una disoluciïn de glicerina; aïadir un lisofosfolïpido y un donante de acilo a la disoluciïn de glicerina; y reesterificar usando la fosfolipasa A2 restante en la disoluciïn de glicerina.

2. El procedimiento para producir un fosfolïpido segïn la reivindicaciïn 1, en el que se aïade un disolvente cetona como disolvente inmiscible con glicerina.

3. El procedimiento para producir un fosfolïpido segïn la reivindicaciïn 1, en el que se aïade un alcohol de 4 ïtomos de carbono o menos despuïs de la esterificaciïn, y se aïade entonces al menos un disolvente seleccionado del grupo consistente en disolventes hidrocarburos, disolventes cetonas y disolventes ïsteres como disolvente inmiscible con glicerina.

4. El procedimiento para producir un fosfolïpido segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la esterificaciïn, se aïade un aminoïcido y/o un pïptido de 3 residuos aminoacïdicos o menos a un sistema de reacciïn, en el que el aminoïcido es al menos uno seleccionado del grupo consistente en glicina, alanina, asparagina, glutamina, isoleucina, leucina, serina, treonina, valina, fenilalanina y tirosina, y en el que el pïptido es una combinaciïn que incluye glicina, alanina y/o serina.