Procedimiento de producción de vitaminas.

Procedimiento para la producción de farnesol o geranilgeraniol,

o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato o geranilgeraniolpirofosfato, mediante el incremento del flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoide, que comprende:

cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética que da lugar a la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09004155.

Solicitante: DCV INC. DOING BUSINESS AS BIO-TECHNICAL RESOURSES.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1035 SOUTH SEVENTH STREET MANITOWOC, WI 54220 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MILLIS,JAMES R, Saucy,Gabriel G, Maurina-Brunker,Julie, McMullin,Thomas W.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01H5/00 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.Plantas con flores, es decir, angiospermas.
  • A61K31/336 A […] › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › teniendo ciclos de tres eslabones, p. ej. oxirano, fumagilina.
  • A61K31/352 A61K 31/00 […] › condensados con carbociclos, p. ej. canabinoles, metantelina.
  • A61K31/353 A61K 31/00 […] › 3,4-Dihidrobenzopiranos, p. ej. cromano, catequina.
  • A61K31/355 A61K 31/00 […] › Tocoferoles, p. ej. vitamina E.
  • C07C403/16 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisis   o electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 403/00 Derivados del ciclohexano o de un ciclohexeno, que contienen una cadena lateral con una parte insaturada de al menos cuatro átomos de carbono en línea, cuya parte está directamente unida a ciclos de ciclohexano o ciclohexeno, p. ej. vitamina A, beta-caroteno, beta-ionona. › que no forman parte de grupos — CHO.
  • C07C403/20 C07C 403/00 […] › que tienen cadenas laterales sustituidas por grupos carboxilo.
  • C07C403/24 C07C 403/00 […] › que tienen cadenas laterales sustituidas por ciclos no aromáticos de seis miembros, p. ej. beta-caroteno.
  • C07C45/41 C07C […] › C07C 45/00 Preparación de compuestos que tienen grupos C = O unidos únicamente a átomos de carbono o hidrógeno; Preparación de los quelatos de estos compuestos. › por hidrogenólisis o por reducción de grupos carboxilo o de sus derivados funcionales.
  • C07D301/03 C07 […] › C07D COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares C08). › C07D 301/00 Preparación de oxiranos. › por oxidación de compuestos insaturados, o de mezclas de compuestos saturados e insaturados.
  • C07D303/04 C07D […] › C07D 303/00 Compuestos que contienen ciclos de tres miembros que tienen un átomo de oxígeno como único heteroátomo del ciclo. › que contienen solamente átomos de hidrógeno y carbono en adición a los átomos de oxígeno del ciclo.
  • C07D311/20 C07D […] › C07D 311/00 Compuestos heterocíclicos que contienen ciclos de seis miembros que contienen un átomo de oxígeno como único heteroátomo, condensados con otros ciclos. › hidrogenados en el heterociclo.
  • C07D311/72 C07D 311/00 […] › Derivados del 3,4-dihidro que tienen en la posición 2 al menos un radical metilo y en la posición 6 un átomo de oxígeno, p. ej. tocoferoles.
  • C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12N9/02 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
  • C12N9/10 C12N 9/00 […] › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12P1/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 1/00 Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas. › utilizando hongos.
  • C12P17/06 C12P […] › C12P 17/00 Preparación de compuestos heterocíclicos que contienen O, N, S, Se o Te como únicos heteroátomos del ciclo (C12P 13/04 - C12P 13/24 tienen prioridad). › que contienen un ciclo de seis miembros, p. ej. fluoresceína.
  • C12P23/00 C12P […] › Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).
  • C12P7/02 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › que contienen un grupo hidroxilo.
  • C12P7/04 C12P 7/00 […] › acíclicos.
  • C12P9/00 C12P […] › Preparación de compuestos orgánicos que contienen un metal o un átomo distinto al H, N, C, O, S o halógeno.

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de producción de vitaminas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos de producción de farnesol o geranilgeraniol o las formas fosfato de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La vitamina E (d-alfa-tocoferol, 1) es un complemento nutricional importante en seres humanos y animales. El compuesto 1 se obtiene comercialmente mediante aislamiento de una variedad de aceites vegetales, o semisintéticamente mediante metilación de anillo del d-gamma-tocoferol 2 de origen natural relacionado. Es una fuente más importante de vitamina E la síntesis total, que proporciona d, l-alfa-tocoferol 3. Aunque es una mezcla de isómeros, 3 proporciona mucha de la actividad biológica de 1 y se usa ampliamente debido a su menor coste y mayor disponibilidad. Para una discusión general de la vitamina E, véase L. Machlin, ed., "Vitamin E: A

El d, l-alfa-tocoferol 3 se obtiene haciendo reaccionar trimetilhidroquinona 4 con fitol 5 o isofitol 6 en presencia de un catalizador ácido, a menudo un ácido de Lewis tal como cloruro de cinc. Esta tecnología se ha revisado por S. Kasparek en L. Machlin, ed., "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", capítulo 2, pág. 8-65, Marcel Dekker, NY, 1965. Las referencias 140-166 de este capítulo proporcionan las referencias primarias de procedimientos detallados de preparación del compuesto 3.

El isofitol 6 o fitol 5 necesarios para la preparación de 3 se obtienen mediante una síntesis multietapa. Los materiales de partida incluyen típicamente acetona (véase Kasparek en Machlin, "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", pág. 44-45, Dekker, NY 1980, y referencias citadas en la misma) y trímero cíclico de isopreno (Pond et al., US 3.917.710 y 3.862.988 (1975) ) .

Además, se preparó en primer lugar gamma-tocoferol mediante síntesis total por Jacob, Steiger, Todd y Wilcox (J. Chem. Soc. 1939, 542) . Estos investigadores produjeron la vitamina haciendo reaccionar el éster de monobenzoato de 2, 3-dimetilhidroquinona con bromuro de fitilo en presencia de cloruro de cinc, seguido de la retirada del benzoato, dando un bajo rendimiento (22%) de gamma-tocoferol. Las síntesis publicadas de tocoferoles y tocotrienoles se han revisado por S. Kasparek en L. Machlin, "Vitamin E - A Comprehensive Treatise", Dekker, NY, 1980; sin embargo, no se han registrado procedimientos adicionales de preparación de gamma-tocoferol.

A pesar de los diversos procedimientos conocidos para preparar o aislar miembros de la familia de la vitamina E de compuestos, continúa habiendo la necesidad de procedimientos de producción mejorados y más eficaces.

Se usan vitamina A (retinol) y la provitamina A º-caroteno en productos farmacéuticos, enriquecimiento alimenticio y complementos dietéticos. El acetato (acetato de retinilo) , propionato (propionato de retinilo) y palmitato (palmitato de retinilo) de la vitamina A son los derivados de vitamina A más generalmente usados. Todos de vitamina A, ésteres de vitamina A y º-caroteno actualmente producidos comercialmente se producen mediante síntesis química total, excepto algo de vitamina A que se aísla a partir de fuentes alimenticias. Véase en general "Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology", volumen 24, páginas 140-158 (3ª ed. 1984) .

Shimada et al. (Julio, 1998) Appl. Environ. Microbiol. 64, 2676-2680, describen una producción aumentada de carotenoides por la levadura para la comida Candida utilis mediante la modificación metabólica del mecanismo de los isoprenoides. Misawa y Shimada (Enero 1998) J. Biotechnol. 59, 169-181 revisan la modificación metabólica para la producción de carotenoides en bacterias y levaduras no carotenogénicas. Kajiwara et al. (1997) Biochem J. 324, 421-426 muestran que la expresión de un gen exógeno de isopentil disfosfato isomerasa aumenta la biosíntesis de isoprenoides en Escherichia coli.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1A ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato. La figura 1B ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides independiente de mevalonato. La figura 2 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de geranilgeraniol. La figura 3 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de farnesol. La figura 4 ilustra el crecimiento y la producción de farnesol de cepas derivadas de la cepa MBNA1-13. La figura 5 ilustra el crecimiento de cepas naturales, erg9 y con ERG9 reparado. La figura 6 ilustra la producción de farnesol en microorganismos con producción amplificada de HMG-CoA reductasa. La figura 7 ilustra la producción de farnesol y GG en cepas que sobreexpresan GGPP sintasas. La figura 8 ilustra el efecto de la producción amplificada de FPP sintasa sobre la producción de farnesol y GG.

La figura 9 ilustra la ruta de conversión metabólica de isoprenol y prenol en farnesol. La figura 10 ilustra una vía de síntesis química para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol. La figura 11 ilustra una vía de síntesis química alternativa para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol. La figura 12 ilustra un procedimiento para preparar -caroteno a partir de retinal usando una reacción de acoplamiento de carbonilo. La figura 13 ilustra un procedimiento para preparar º-caroteno usando una reacción de alquilación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1.0 Introducción

La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato o geranilgeraniolpirofosfato, mediante el incremento del flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoide, que comprende: cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética que da lugar a la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

La presente invención también proporciona un microorganismo que comprende una modificación genética para incrementar la expresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética adicional para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

Las realizaciones adicionales de la invención se establecen en las figuras que se acompañan.

2.0 Producción biológica de farnesol y GG

Los isoprenoides son la mayor familia de productos naturales, con aproximadamente 22.000 estructuras diferentes conocidas. Todos los isoprenoides derivan del compuesto C5 pirofosfato de isopentilo (IPP) . Por tanto, las cadenas principales carbonadas de todos los compuestos isoprenoides se crean mediante adiciones secuenciales de las unidades C5 a la cadena poliprenoide en crecimiento.

Aunque las etapas biosintéticas que conducen desde IPP a isoprenoides son universales, existen dos rutas diferentes que conducen a IPP. Los hongos (tales como levadura) y animales poseen la ruta dependiente de mevalonato bien conocida (exhibida en La figura 1A) que usa acetil CoA como precursor inicial. Las bacterias y plantas superiores, por otro lado, poseen una ruta independiente de mevalonato recién descubierta, también designada en la presenta memoria como la ruta sin mevalonato (exhibida en La figura 1B) que parte desde piruvato y 3-fosfato de gliceraldehído [Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2105-2110 (1998) ; Rohmer et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2564-2566 (1996) ; Arigoni, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997) ; Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998) ]. En plantas (incluyendo microalgas) , hay evidencias de que existen ambas rutas dependiente e independiente de mevalonato, siendo la primera citosólica y la segunda plastídica [Arigoni, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997) ; Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998) ]. Se han establecido varias etapas de la ruta independiente de mevalonato. La primera etapa, catalizada por 5-fosfato... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la producción de farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato o geranilgeraniolpirofosfato, mediante el incremento del flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoide, que comprende:

cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética que da lugar a la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la expresión de IPP isomerasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además recuperar farnesol o geranilgeraniol.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo comprende un gen de escualeno sintasa bajo el control de un promotor inducible o represible.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de escualeno sintasa está bajo el control de un promotor inducible y el microorganismo se cultiva bajo condiciones en las que el inductor para dicho promotor se agota en el medio.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la expresión de HMG-CoA reductasa se incrementa mediante el incremento del número de copias del gen.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo se modifica genéticamente adicionalmente para incrementar la expresión de acetoacetil Co-A tiolasa, y HMG-CoA sintasa.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el microorganismo ha sido modificado genéticamente para incrementar la expresión de farnesil pirofosfato sintasa.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar farnesil pirofosfato sintasa.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho microorganismo es un hongo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho hongo es una levadura.

12. Microorganismo que comprende una modificación genética para incrementar la expresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética adicional para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

 

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