Procedimiento para la producción de farnesol o geranilgeraniol,

o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato o geranilgeraniolpirofosfato, mediante el incremento del flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoide, que comprende:

cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética que da lugar a la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

Procedimiento de producción de vitaminas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos de producción de farnesol o geranilgeraniol o las formas fosfato de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La vitamina E (d-alfa-tocoferol, 1) es un complemento nutricional importante en seres humanos y animales. El compuesto 1 se obtiene comercialmente mediante aislamiento de una variedad de aceites vegetales, o semisintéticamente mediante metilación de anillo del d-gamma-tocoferol 2 de origen natural relacionado. Es una fuente más importante de vitamina E la síntesis total, que proporciona d, l-alfa-tocoferol 3. Aunque es una mezcla de isómeros, 3 proporciona mucha de la actividad biológica de 1 y se usa ampliamente debido a su menor coste y mayor disponibilidad. Para una discusión general de la vitamina E, véase L. Machlin, ed., "Vitamin E: A

El d, l-alfa-tocoferol 3 se obtiene haciendo reaccionar trimetilhidroquinona 4 con fitol 5 o isofitol 6 en presencia de un catalizador ácido, a menudo un ácido de Lewis tal como cloruro de cinc. Esta tecnología se ha revisado por S. Kasparek en L. Machlin, ed., "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", capítulo 2, pág. 8-65, Marcel Dekker, NY, 1965. Las referencias 140-166 de este capítulo proporcionan las referencias primarias de procedimientos detallados de preparación del compuesto 3.

El isofitol 6 o fitol 5 necesarios para la preparación de 3 se obtienen mediante una síntesis multietapa. Los materiales de partida incluyen típicamente acetona (véase Kasparek en Machlin, "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", pág. 44-45, Dekker, NY 1980, y referencias citadas en la misma) y trímero cíclico de isopreno (Pond et al., US 3.917.710 y 3.862.988 (1975) ) .

Además, se preparó en primer lugar gamma-tocoferol mediante síntesis total por Jacob, Steiger, Todd y Wilcox (J. Chem. Soc. 1939, 542) . Estos investigadores produjeron la vitamina haciendo reaccionar el éster de monobenzoato de 2, 3-dimetilhidroquinona con bromuro de fitilo en presencia de cloruro de cinc, seguido de la retirada del benzoato, dando un bajo rendimiento (22%) de gamma-tocoferol. Las síntesis publicadas de tocoferoles y tocotrienoles se han revisado por S. Kasparek en L. Machlin, "Vitamin E - A Comprehensive Treatise", Dekker, NY, 1980; sin embargo, no se han registrado procedimientos adicionales de preparación de gamma-tocoferol.

A pesar de los diversos procedimientos conocidos para preparar o aislar miembros de la familia de la vitamina E de compuestos, continúa habiendo la necesidad de procedimientos de producción mejorados y más eficaces.

Se usan vitamina A (retinol) y la provitamina A º-caroteno en productos farmacéuticos, enriquecimiento alimenticio y complementos dietéticos. El acetato (acetato de retinilo) , propionato (propionato de retinilo) y palmitato (palmitato de retinilo) de la vitamina A son los derivados de vitamina A más generalmente usados. Todos de vitamina A, ésteres de vitamina A y º-caroteno actualmente producidos comercialmente se producen mediante síntesis química total, excepto algo de vitamina A que se aísla a partir de fuentes alimenticias. Véase en general "Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology", volumen 24, páginas 140-158 (3ª ed. 1984) .

Shimada et al. (Julio, 1998) Appl. Environ. Microbiol. 64, 2676-2680, describen una producción aumentada de carotenoides por la levadura para la comida Candida utilis mediante la modificación metabólica del mecanismo de los isoprenoides. Misawa y Shimada (Enero 1998) J. Biotechnol. 59, 169-181 revisan la modificación metabólica para la producción de carotenoides en bacterias y levaduras no carotenogénicas. Kajiwara et al. (1997) Biochem J. 324, 421-426 muestran que la expresión de un gen exógeno de isopentil disfosfato isomerasa aumenta la biosíntesis de isoprenoides en Escherichia coli.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1A ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato. La figura 1B ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides independiente de mevalonato. La figura 2 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de geranilgeraniol. La figura 3 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de farnesol. La figura 4 ilustra el crecimiento y la producción de farnesol de cepas derivadas de la cepa MBNA1-13. La figura 5 ilustra el crecimiento de cepas naturales, erg9 y con ERG9 reparado. La figura 6 ilustra la producción de farnesol en microorganismos con producción amplificada de HMG-CoA reductasa. La figura 7 ilustra la producción de farnesol y GG en cepas que sobreexpresan GGPP sintasas. La figura 8 ilustra el efecto de la producción amplificada de FPP sintasa sobre la producción de farnesol y GG.

La figura 9 ilustra la ruta de conversión metabólica de isoprenol y prenol en farnesol. La figura 10 ilustra una vía de síntesis química para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol. La figura 11 ilustra una vía de síntesis química alternativa para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol. La figura 12 ilustra un procedimiento para preparar -caroteno a partir de retinal usando una reacción de acoplamiento de carbonilo. La figura 13 ilustra un procedimiento para preparar º-caroteno usando una reacción de alquilación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1.0 Introducción

La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato o geranilgeraniolpirofosfato, mediante el incremento del flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoide, que comprende: cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética que da lugar a la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

La presente invención también proporciona un microorganismo que comprende una modificación genética para incrementar la expresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética adicional para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

Las realizaciones adicionales de la invención se establecen en las figuras que se acompañan.

2.0 Producción biológica de farnesol y GG

Los isoprenoides son la mayor familia de productos naturales, con aproximadamente 22.000 estructuras diferentes conocidas. Todos los isoprenoides derivan del compuesto C5 pirofosfato de isopentilo (IPP) . Por tanto, las cadenas principales carbonadas de todos los compuestos isoprenoides se crean mediante adiciones secuenciales de las unidades C5 a la cadena poliprenoide en crecimiento.

Aunque las etapas biosintéticas que conducen desde IPP a isoprenoides son universales, existen dos rutas diferentes que conducen a IPP. Los hongos (tales como levadura) y animales poseen la ruta dependiente de mevalonato bien conocida (exhibida en La figura 1A) que usa acetil CoA como precursor inicial. Las bacterias y plantas superiores, por otro lado, poseen una ruta independiente de mevalonato recién descubierta, también designada en la presenta memoria como la ruta sin mevalonato (exhibida en La figura 1B) que parte desde piruvato y 3-fosfato de gliceraldehído [Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2105-2110 (1998) ; Rohmer et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2564-2566 (1996) ; Arigoni, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997) ; Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998) ]. En plantas (incluyendo microalgas) , hay evidencias de que existen ambas rutas dependiente e independiente de mevalonato, siendo la primera citosólica y la segunda plastídica [Arigoni, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10600-10605 (1997) ; Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2100-2104 (1998) ]. Se han establecido varias etapas de la ruta independiente de mevalonato. La primera etapa, catalizada por 5-fosfato... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato o geranilgeraniolpirofosfato, mediante el incremento del flujo de carbono a través de la ruta de isoprenoide, que comprende:

cultivar un microorganismo en un medio de fermentación, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética que da lugar a la sobreexpresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo comprende además una modificación genética para incrementar la expresión de IPP isomerasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además recuperar farnesol o geranilgeraniol.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo comprende un gen de escualeno sintasa bajo el control de un promotor inducible o represible.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho gen de escualeno sintasa está bajo el control de un promotor inducible y el microorganismo se cultiva bajo condiciones en las que el inductor para dicho promotor se agota en el medio.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la expresión de HMG-CoA reductasa se incrementa mediante el incremento del número de copias del gen.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo se modifica genéticamente adicionalmente para incrementar la expresión de acetoacetil Co-A tiolasa, y HMG-CoA sintasa.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el microorganismo ha sido modificado genéticamente para incrementar la expresión de farnesil pirofosfato sintasa.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el microorganismo se ha modificado genéticamente para sobreexpresar farnesil pirofosfato sintasa.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho microorganismo es un hongo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho hongo es una levadura.

12. Microorganismo que comprende una modificación genética para incrementar la expresión de HMG-CoA reductasa, o el dominio catalítico de la misma, junto con una modificación genética para incrementar la expresión de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa y difosfomevalonato descarboxilasa, y una modificación genética adicional para disminuir la expresión de escualeno sintasa mediante la represión de un gen ERG9 endógeno.