Procedimiento citológico que utiliza la autofluorescencia de los glóbulos blancos para el diagnóstico precoz y el seguimiento de las infecciones.

Procedimiento in vitro para diagnosticar el estado infeccioso de un individuo a partir de una muestra de glóbulos blancos procedente de una extracción biológica de dicho individuo,

que comprende por lo menos las etapas siguientes:

i) medir la intensidad celular media de autofluorescencia de dicha muestra, y

ii) comparar la intensidad medida en la etapa i) con un valor control, de manera que se determine el estado infeccioso de dicho individuo.

Procedimiento citologico que utiliza la autofluorescencia de los glóbulos blancos para el diagnóstico precoz y el seguimiento de las infecciones.

Técnica anterior

La sepsis severa o infección bacteriana grave sigue siendo una causa importante de morbl-mortalldad hospitalaria, más precisamente en las unidades de cuidados intensivos o de reanimación. Su Incidencia actual de 3 a 11 casos por 1000 habitantes en Estados Unidos ha aumentado de hecho el 8,7% por año estos diez últimos años. El 14,6% de las admisiones en las unidades de reanimación francesas están relacionadas con esta patología. A pesar de numerosos progresos en los procedimientos diagnósticos y terapéuticos, la mortalidad hospitalaria relacionada con la sepsis severa se estima en el 35% en Francia. Se ha demostrado actualmente de manera clara que el periodo de tiempo que separa la admisión de pacientes del ¡nielo de la antlbloterapla constituye un importante factor pronóstico de mortalidad. El objetivo es, por lo tanto, en el siglo 21, diagnosticar la Infección lo más pronto posible, lo que es una garantía de supervivencia de los pacientes.

Además, uno de los desafíos actuales en medicina es poder reducir la masa global de antibióticos utilizados diariamente con el fin de combatir los efectos nocivos de su empleo masivo (resistencia bacteriana y costes económicos). La duración de los tratamientos con antibióticos de las Infecciones bacterianas está actualmente en el centro de los principales debates. Son así necesarias técnicas rápidas de monltorlzaclón de la infección en curso y por lo tanto de la eficacia de los tratamientos antl-lnfecclosos empleados. Estas técnicas permitirán detener los tratamientos en el momento adecuado y darán lugar a un acortamiento del tiempo de los tratamientos con antibióticos. Por lo tanto, conllevarán una reducción del consumo mundial de antibióticos.

Ahora bien, las técnicas mlcroblológlcas clásicas actualmente disponibles que constituyen el examen directo y el cultivo sobre medios nutritivos, no permiten el acceso a una respuesta rápida. En efecto, son necesarias de 24 a 48 horas para la obtención de una respuesta diagnóstica bacteriológica. Asimismo, las técnicas de amplificación gènica (RT-PCR por ejemplo) son muy caras, ya que utilizan unos aparatos sofisticados y no están todavía completamente validadas en una indicación diagnóstica.

Para sustituir estas técnicas mlcrobiológicas o genéticas, existe por lo tanto una necesidad urgente de desarrollar unos procedimientos fiables y poco costosos, que permitan diagnosticar Infecciones de manera bastante precoz en su desarrollo, de manera mucho más rápida de lo que está permitido actualmente.

Ahora bien, se sabe que la respuesta del huésped a los microorganismos se establece en los primeros minutos de la Infección: de hecho es casi inmediata. Los glóbulos blancos, células clave de la Inmunidad Innata, desempeñan un papel fundamental y muy precoz en el reconocimiento y la destrucción de los agentes patógenos. Estos mecanismos de defensa del huésped contra los microbios (bacterias y virus) están bajo la dependencia de receptores específicos, los receptores Toll-like (TLR). Varios de estos TLR desempeñan un papel primordial en el reconocimiento de las bacterias: el TLR4, por ejemplo, reconoce los componentes de la membrana de las bacterias gram-negatlvas, como el lipopolisacárido (LPS), mientras que el TLR2 reconoce unos elementos de las bacterias gram positivas, como el peptidoglicano (PGN). Los TLR3, 7 y 8 son unos receptores endosomales que reconocen los ARN de los virus. Una vez estimulados, estos TLR tienen como característica común dar lugar a la activación del factor de transcripción nuclear NF-xB y la producción de citoquinas pro-inflamatorias NF-xB dependientes, como el Factor de Necrosis Tumoral a (TNF a) y la interleucina 6 (IL-6). Por otra parte, otra vía de señalización constituye un mecanismo de defensa importante de la inmunidad innata: la vía del receptor de la N-formil-L-metionil-L-leucll-L-fenilalanina (fMLP). Este péptido, producido de la degradación de proteínas bacterianas, activa un receptor acoplado a proteínas G que da lugar a una cascada de activación de quinasas intra-citoplásmicas que llevan a la fosforilación de sub-unidades cuyo ensamblaje forma la NADH-oxidasa. Este complejo enzimàtico membranario permite que los monocitos y los neutrófilos polinucleares (PNN) produzcan unas especies reactivas del oxígeno (ERO) oxidando el NADH en NAD. Estos ERO participan en la actividad bactericida de los fagocitos.

Los presentes inventores muestran en la presente memoria que es posible utilizar, en condiciones experimentales muy particulares, la autofluorescencia de estos glóbulos blancos para revelar la actividad inmunitaria precoz que se establece durante la infección microbiana (y por lo tanto el estado infeccioso de un individuo). El procedimiento de diagnóstico de la invención utiliza un material óptico de rutina que permite trabajar en unos ámbitos de longitudes de onda compatibles con la autofluorescencia celular, y constituye así una ayuda rápida, fiable y poco costosa para el diagnóstico de una infección en un individuo. Permite también controlar muy rápidamente la eficacia de las terapias anti-infecciosas establecidas previamente.

Resumen de ¡a invención

La presente invención se refiere en primer lugar a un procedimiento /n v/fro para diagnosticar el estado infeccioso de un individuo a partir de una muestra de glóbulos blancos procedentes de una extracción biológica de dicho Individuo, que comprende por lo menos las etapas siguientes:

i) medir la intensidad celular mediante autofluorescencia de dicha muestra, y

¡i) comparar la intensidad medida en la etapa i) con un valor control, con el fin de determinar el estado infeccioso de dicho individuo.

En un modo de realización particular, los glóbulos blancos de dicha muestra se seleccionan de entre los monocitos y/o los neutrófilos polinucleares. En este modo de realización de la invención, cuando el estado de dicho individuo es infeccioso, dicho individuo padece una infección bacteriana, viral ofúngica, preferentemente bacteriana.

Preferentemente, dicha extracción biológica es un fluido procedente de un órgano potencialmente infectado de dicho individuo, de manera aún más preferida, esta extracción es un fiuido pulmonar, un líquido de ascitis, un fluido cefalorraquídeo, una extracción sanguínea o cualquier otro fiuido biológico procedente de un órgano potencialmente infectado.

En un modo de realización preferido, la intensidad de la autofluorescencia de las células de dicha muestra se mide sobre células fijadas químicamente, mediante un microscopio de florescencia, un citómetro de flujo, un espectrofluorímetro o cualquier otro dispositivo óptico capaz de medir la florescencia.

En un modo de realización preferido entre todos, la muestra de células se prepara en monocapa sobre portaobjetos de material transparente, preferentemente de vidrio, previamente a la etapa i), según un procedimiento que comprende por lo menos las etapas siguientes:

a) depositar unas células de dicha muestra en por lo menos un sistema de citocentrifugación,

b) centrifugar el dispositivo obtenido en la etapa a), preferentemente a aproximadamente 600 rpm durante aproximadamente 5 minutos, con el fin de proyectar las células sobre dicho portaobjetos,

c) fijar las células así proyectadas sobre el portaobjetos para formar una muestra celular, con por lo menos una gota de paraformaldehído (PFA) al 4% aproximadamente, preferentemente durante 10 minutos

aproximadamente,

d) aclarar la muestra celular anteriormente fijada, preferentemente con un tampón PBS,

e) dejar secar la muestra celular anteriormente aclarada,

f) añadir sobre la muestra celular anteriormente secada por lo menos una gota de un medio de montaje compatible con la observación de la florescencia,

g) fijar una laminilla cubreobjetos transparente, preferentemente de vidrio, sobre la muestra celular procedente de la etapa f).

Cuando los glóbulos blancos de dicha muestra son mayoritariamente unos monocitos, el estado de dicho individuo es infeccioso si la intensidad de la autofíuorescencia medida en la etapa i) es significativamente superior al valor de control.

Cuando los glóbulos blancos de dicha muestra son mayoritariamente unos polinucleares neutrófilos, el estado de dicho individuo es infeccioso si la intensidad de la autofíuorescencia medida en la etapa i) es significativamente inferior al valor control.

Leyenda de tas figuras

La figura 1 está constituida por dos imágenes (A, B) tomadas por un microscopio confocal, que revela... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento /n v/fro para diagnosticar el estado infeccioso de un individuo a partir de una muestra de glóbulos blancos procedente de una extracción biológica de dicho individuo, que comprende por lo menos las etapas siguientes:

i) medir la intensidad celular media de autofluorescencia de dicha muestra, y

¡i) comparar la intensidad medida en la etapa i) con un valor control, de manera que se determine el estado infeccioso de dicho individuo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que los glóbulos blancos de dicha muestra se seleccionan de entre los monocitos y/o los neutrófilos polinucleares.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que, cuando el estado de dicho individuo es infeccioso, dicho individuo padece una infección bacteriana, viral o fúngica, preferentemente bacteriana.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha extracción biológica es un fluido procedente de un órgano de dicho individuo.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha extracción biológica es un fiuido pulmonar, un líquido de ascitis, un fluido cefalorraquídeo, una extracción sanguínea o un fiuido de cualquier otro órgano potencialmente infectado.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la intensidad de la autofluorescencia de las células de dicha muestra se mide sobre unas células en suspensión.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que la intensidad de la autofiuorescencia de dichas células en suspensión se mide por citometría de flujo o por espectrofotometría.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la intensidad de la autofluorescencia de las células de dicha muestra se mide sobre unas células fijadas químicamente y colocadas en un portaobjetos compatible con la observación de la fluorescencia, preferentemente un portaobjetos de vidrio transparente.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la intensidad de la autofluorescencia de las células de dicha muestra se mide con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 y 9, en el que dicha muestra de células se prepara en monocapa sobre un portaobjetos de material transparente antes de la etapa i), según un procedimiento que comprende por lo menos las etapas siguientes:

a) depositar las células de dicha muestra en por lo menos un sistema de citocentrifugación,

b) centrifugar el dispositivo obtenido en la etapa a), preferentemente a aproximadamente 600 rpm, durante aproximadamente 5 minutos, de manera que las células se proyecten sobre dicho portaobjetos,

c) fijar químicamente las células así proyectadas sobre el portaobjetos para formar un punto celular, con por lo menos una gota de paraformaldehído (PFA) al 4% aproximadamente, preferentemente durante 10 minutos aproximadamente,

d) aclarar el punto celular anteriormente fijado, preferentemente con tampón PBS,

e) dejar secar el punto celular anteriormente aclarado,

f) añadir sobre el punto celular anteriormente secado por lo menos una gota de un medio de montaje compatible con la observación de la fluorescencia,

g) colocar una laminilla cubreobjetos transparente, preferentemente de vidrio, sobre el punto celular procedente de la etapa f).

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que, cuando los glóbulos blancos de dicha muestra son mayoritariamente unos monocitos, el estado de dicho individuo es infeccioso si la intensidad de la autofluorescencia medida en la etapa i) es significativamente superior al valor control.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que, cuando los glóbulos

blancos de dicha muestra son mayoritariamente unos polinucleares neutrófilos, el estado de dicho individuo es infeccioso si la intensidad de la autofluorescencia medida en la etapa i) es significativamente inferior al valor control.