Preparación de polilisina y poliornitina de bajo peso molecular con alto rendimiento.

Un procedimiento para preparar un polímero polilisina o poliornitina que comprende unidades que se repiten que corresponden a la fórmula 3 o una sal de la misma,

y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000 Daltons y un índice de polidispersidad de 1,2-1,5, comprendiendo el procedimiento:

hidrolizar un producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida que comprende unidades que se repiten que corresponden a la fórmula 3 o una sal de la misma y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 12.500 Daltons a aproximadamente 22.000 Daltons, en el que la fórmula 3 tiene la estructura:

Fórmula 3

n es 3 o 4; y

la hidrólisis del producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida se lleva a cabo durante un tiempo de reacción calculado a partir del peso molecular medido mediante la viscosidad del producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/052085.

Solicitante: Sigma-Aldrich Co. LLC.

Inventor/es: PONNUSAMY,ETTIGOUNDER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.

PDF original: ES-2537022_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Preparación de polilisina y poliornitina de bajo peso molecular con alto rendimiento 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere en general a la preparación a gran escala (escala mayor de 1 kg) de polilisina o poliornitina de bajo peso molecular con alto rendimiento, mediante la preparación de un producto intermedio de polilisina o poliornitina que tiene un peso molecular medio ponderado basado en Usina u ornitina de

10 aproximadamente 12.500 Daltons a aproximadamente 22.00 Daltons, y la hidrólisis para producir una polilisina o poliornitina que tiene un peso molecular medio ponderado de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente

12.000 Daltons. En realizaciones preferidas, el procedimiento se usa para preparar polilisina. En algunas de estas realizaciones, el polímero es un homopolímero de poli-L-lisina.

15 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La polilisina y poliornitina son conocidas y se están investigando como agentes de condensación de ADN para usar en terapia génica no vírica. Sin embargo, como se conoce en la bibliografía, la poli-L-lisina tiene efectos citotóxicos que disminuyen con la disminución del peso molecular. Por lo tanto, es deseable la preparación

20 de una polilisina de bajo peso molecular.

[0003] La poli-L-lisina y otros poliaminoácidos se han preparado por una variedad de rutas. Comercialmente, la poli-L-lisina se ha preparado por reacción del N-carboxianhídrido de N'-carbobencilox¡(Cbz)-L-l¡s¡na con un iniciador de polimerización para producir poli-N'-Cbz-L-lisina. La poli-N'-Cbz-L-lisina se trata con ácido bromhídrico

25 en ácido acético para separar el grupo Cbz y formar poli-L-lisina que tiene un peso molecular de aproximadamente

7.000 Daltons. El producto se puede dializar, liofilizar, y recuperar con un 11-30% de rendimiento. Este rendimiento del procedimiento actual es variable y es inaceptablemente bajo. Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos a gran escala con rendimientos más altos que tengan menor variabilidad para producir polilisina que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000

30 Daltons.

[0004] Waley y col., (1953), Jouma/of B/oc/iem/sf;y, volumen 55, páginas 328 - 337, describen la acción de la tripsina en la polilisina.

35 [0005] El documento US 7317070 describe un procedimiento mejorado para preparar poliaminoácidos en general, y más específicamente poli(ácido glutámico) y poli(ácido aspártico). También se describe un procedimiento para la preparación a gran escala (es decir, > 1 kg) de poliaminoácidos, en particular poli(ácido glutámico) y poli(ácido aspártico).

40 [0006] Van Dijk-Wolthuis y col., (1997), Macromo/. C/iem. Phys., volumen 198, páginas 3893-3906, describen la síntesis y caracterización de poli-L-lisina con peso molecular bajo controlado.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

45 [0007] Entre los diferentes aspectos de la invención hay un procedimiento para preparar una polilisina o poliornitina de peso molecular relativamente bajo a gran escala con alto rendimiento.

[0008] De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar un polímero polilisina o poliornitina que comprende unidades que se repiten que corresponden a la fórmula 3 o una sal de la

50 misma, y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000 Daltons y un índice de polidispersidad de 1,2-1,5, comprendiendo el procedimiento:

hidrolizar un producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida que comprende unidades que se repiten 55 que corresponden a la fórmula 3 o una sal de la misma y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 12.500 Daltons a aproximadamente 22.000 Daltons, en el que

[0009] la fórmula 3 tiene la estructura:

(CHz)n---------NHz

H !

f-N------C------Ct

^ H ^

O

Fórnrtula3

nes3o4;y

la hidrólisis del producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida se lleva a cabo durante un tiempo de reacción calculado a partir del peso molecular medido mediante la viscosidad del producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida.

10 [0010] El procedimiento de la invención descrito antes puede comprender además eliminar el grupo protector de nitrógeno de un producto intermedio de polilisina o poliornitina protegida que comprende unidades que se repiten de fórmula 2 o una sal del mismo, y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 12.500 Daltons a aproximadamente 22.000 Daltons, en el que la fórmula 2 tiene la estructura

(CH2)---------NHRi

**(Ver fórmula)**

Fórmula 2

Ri es un grupo protector de amino; y n es 3 o 4.

20 [0011] Los diferentes procedimientos descritos antes pueden comprender además la preparación del producto intermedio de polilisina o poliornitina protegida, por polimerización de un compuesto N-carboxianhídrido de fórmula 1, en donde la fórmula 1 tiene la estructura

(CHz)n--------NHRi

**(Ver fórmula)**

Ri es un grupo protector de amino; y n es 3 o 4.

[0012] Otros objetos y características serán en parte evidentes y en parte se señalan en lo sucesivo.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

[0013] Ventajosamente, la polilisina o poliornitina se pueden preparar de acuerdo con el procedimiento de la presente invención de una forma relativamente más eficaz y/o productiva. En general, el polímero polilisina o

35 poliornitina comprende unidades que se repiten que corresponden a la fórmula 3, sal N*= o sales N^ de la misma:

(CH2)--------NHg

**(Ver fórmula)**

o

Fórmula 3

en donde n es 3 (es decir, poliornitina) o 4 (es decir, polilisina). El producto polímero polilisina o poliornitina 5 comprende una mezcla de moléculas que tienen unidades que se repiten de fórmula 3 para formar un polímero que tiene una peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000 Daltons.

[0014] En general, los homopolímeros de polilisina pueden estar compuestos de isómeros D, L o una mezcla 10 racémica de las unidades de lisina que se repiten. En realizaciones preferidas, la polilisina comprende poli-L-lisina.

Además, los homopolímeros de poliornitina pueden estar compuestos de isómeros D, L o una mezcla racémica de las unidades de ornitina que se repiten. En realizaciones preferidas, la poliornitina comprende poli-L-ornitina. La estereoquímica de la polilisina o poliornitina está determinada por la estereoquímica del monómero de partida. Las estructuras de fórmulas 1, 2 y 3 representan monómeros y polímeros que tienen una estereoquímica D, L o una 15 mezcla de D y L.

[0015] Independientemente de la composición de las unidades que se repiten, el procedimiento de la presente invención permite la preparación de polilisina que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000 Daltons. Para algunas aplicaciones, se desea polilisina

20 que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina de aproximadamente 7.000 Daltons a aproximadamente 10.000 Daltons. El procedimiento también permite la preparación de poliornitina que tiene un peso molecular medio ponderado basado en ornitina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000 Daltons

25 [0016] Para los propósitos de esta solicitud, el peso molecular medio ponderado se determina usando la cromatografía de permeabilidad en geles con técnica de dispersión de la luz láser de multiángulo (GPC MALLS) que proporciona un peso molecular medio ponderado absoluto y el índice de polidispersidad.

Polimerización

[0017] La polilisina o poliornitina de la presente invención se puede preparar por un procedimiento que empieza con la polimerización de un N-carboxianhídrido de una Usina N'-protegida o una ornitina N^-protegida, en un medio de polimerización que comprende un disolvente adecuado. La polimerización preferiblemente se lleva a cabo en presencia de un iniciador de polimerización contenido en el medio de reacción.

[0018] La preparación de N-carboxianhídridos de Usinas y ornitinas protegidas es conocida. En general la lisina u ornitina protegida se trata con fosgeno en un disolvente tipo éter (p. ej., tetrahidrofurano) para producir el correspondiente N-carboxianhídrido de Usina N'-protegida, o N-carboxianhídrido de ornitina N^-protegida. En algunas realizaciones, el N-carboxianhídrido de lisina... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para preparar un polímero polilisina o poliornitina que comprende unidades que se

repiten que corresponden a la fórmula 3 o una sal de la misma, y que tiene un peso molecular medio ponderado 5 basado en lisina u ornitina de aproximadamente 5.500 Daltons a aproximadamente 12.000 Daltons y un índice de polidispersidad de 1,2-1,5, comprendiendo el procedimiento:

hidrolizar un producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida que comprende unidades que se repiten que corresponden a la fórmula 3 o una sal de la misma y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en 10 lisina u ornitina de aproximadamente 12.500 Daltons a aproximadamente 22.000 Daltons, en el que

la fórmula3tiene la estructura:

(CH^p--------NH,

H I

"T"------cC-T-

o

Fórmula 3

n es 3 o 4; y

la hidrólisis del producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida se lleva a cabo durante un tiempo de 20 reacción calculado a partir del peso molecular medido mediante la viscosidad del producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la preparación de dicho producto intermedio de

polilisina o poliornitina desprotegida comprende

eliminar el grupo protector de nitrógeno de un producto intermedio de polilisina o poliornitina protegida que comprende unidades que se repiten de fórmula 2 o una sal de la misma, y que tiene un peso molecular medio ponderado basado en lisina u ornitina de aproximadamente 12.500 Daltons a aproximadamente 22.000 Daltons, en el que

30 la fórmula2tiene la estructura

Ri es un grupo protector de amino; y 35nes3o4.

(CH^n-------NHR,

H

**(Ver fórmula)**

Fórmula2

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que la preparación del producto intermedio de

polilisina o poliornitina protegida comprende la polimerización de un compuesto N-carboxianhídrido de fórmula 1, en el que la fórmulal tiene la estructura

(CHz)n------NHRi

**(Ver fórmula)**

4. El procedimiento de la reivindicación 2 o 3, en el que la hidrólisis del producto intermedio de polilisina 5 o poliornitina desprotegida y la eliminación del grupo protector del nitrógeno del producto intermedio de polilisina o

poliornitina protegida se llevan a cabo simultáneamente.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el grupo protector de amino es carbobenciloxi, t-butoxicarbonilo o aliloxicarbonilo.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la polimerización se lleva a cabo en presencia de un iniciador.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que la polimerización se lleva a 15 cabo en un medio disolvente orgánico, y la eliminación del grupo protector del nitrógeno del producto intermedio de

polilisina o poliornitina protegida comprende introducir una combinación de un ácido mineral y un ácido orgánico en dicho medio disolvente orgánico, formando así un precipitado que comprende unidades que se repiten que consisten en la sal N' o hP de las unidades que se repiten de fórmula 3 y dicho ácido mineral.

20 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, que comprende eliminar oligómeros

y otros componentes de bajo peso molecular de una solución que comprende el producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida antes de hidrólisis de dicho producto intermedio desprotegido.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el producto intermedio de polilisina o poliornitina 25 desprotegida y oligómeros asociados y/u otros componentes de bajo peso molecular se recogen en un medio

acuoso, y el medio acuoso que contiene el polímero intermedio desprotegido y oligómeros y/u otros componentes de bajo peso molecular se pone en contacto con una superficie de una membrana de diálisis que tiene un medio acuoso en la superficie opuesta de la misma en el que los oligómeros y otros componentes de bajo peso molecular son recibidos en la diálisis, produciendo así un retenido que comprende producto intermedio de polilisina o 30 poliornitina desprotegida de contenido reducido de oligómero.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el retenido se liofiliza para dar un producto intermedio de polilisina o poliornitina desprotegida sólido.

35 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en donde el producto intermedio de polilisina o poliornitina

desprotegida sólido se recoge en una solución acuosa en la que se pone en contacto con un ácido mineral para la hidrólisis.

12. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la polimerización del compuesto N-carboxianhídrido 40 se lleva a cabo en un medio de reacción de polimerización que comprende un disolvente no polar.

13. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el rendimiento de polímero de polilisina o poliornitina es mayor que aproximadamente 45% basado en la cantidad de compuesto N-carboxianhídrido.

45 14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polímero de polilisina

es poli-L-lisina, poli-D-lisina, o una mezcla racémica de los mismos, o el polímero de poliornitina es poli-L-ornitina, poli-D-ornitina, o una mezcla racémica de los mismos.


 

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