Matrices de afinidad mejorada con visibilidad mejorada para aplicaciones de arrastre molecular e inmunoprecipitación.

Una matriz de afinidad para el aislamiento de una molécula a partir de una solución acuosa,

comprendiendo la matriz de afinidad un soporte polimérico en partículas que contiene una mezcla de partículas, en donde una primera fracción de partículas de la mezcla tienen un colorante unido covalentemente para permitir la detección óptica de la soporte polimérico, y una segunda fracción de partículas de la mezcla tienen un ligando de afinidad distinto del colorante unido para la captura de la molécula, en donde ninguna de las partículas de la mezcla contiene tanto el colorante como el ligando de afinidad.

Matrices de afinidad mejorada con visibilidad mejorada para aplicaciones de arrastre molecular e inmunoprecipitación 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los experimentos de arrastre molecular basado en la afinidad (captura de inmunoafinidad) e inmunoprecipitación son procedimientos potentes y ampliamente utilizados para estudiar la expresión, modificación e interacción de las proteínas en una amplia variedad de sistemas biológicos. Los experimentos de arrastre molecular basado en la afinidad e inmunoprecipitación han dado como resultado la rápida purificación de proteínas recombinantes marcadas con epítopos, el descubrimiento y caracterización de modificaciones de proteínas postraduccionales reversibles, y una variedad de otras observaciones, que han aumentado la comprensión de los procesos biológicos en el nivel molecular.

La estrategia que subyace tras la técnica de arrastre molecular basado en la afinidad consiste en utilizar la afinidad de las biomoléculas como procedimiento para seleccionar moléculas diana a partir de una solución. Un ligando de afinidad, tal como un anticuerpo, se fija a una matriz en partículas, tal como agarosa, y el conjugado resultante se usa para localizar y unirse a su diana, tal como un antígeno en particular, a partir de una preparación biológica o bioquímica.

La inmunoprecipitación es un tipo de experimento de arrastre molecular basado en la afinidad. Los experimentos de arrastre molecular basado en la afinidad purifican por afinidad complejos usando cualquier ligando de afinidad que se conjuga directamente a un soporte polimérico que tiene una afinidad específica por determinadas 25 dianas biomoleculares. Sin embargo, los procedimientos generales de un experimento de arrastre molecular basado en la afinidad se pueden ilustrar mediante los procedimientos involucrados en un experimento de inmunoprecipitación. El procedimiento básico de inmunoprecipitación implica tres etapas. La primera etapa es la preparación de la solución de antígeno. La segunda etapa consiste en la separación previa del lisado del fondo no específico, y la tercera etapa es la formación y la purificación de los inmunocomplejos. Una vez purificado, se puede aplicar cualquiera de una serie de procedimientos para analizar los antígenos. La variedad de procedimientos que se pueden utilizar específicamente en las técnicas de arrastre molecular basado en la afinidad e inmunoprecipitación se describen con detalle en el documento de Harlow, E. y Lane, D. (eds.) , «Antibodies: a Laborator y Manual», Capítulo 7, Cold Spring Harbor Press, NY (1988) .

La inmunoprecipitación se realiza generalmente en un lisado preparado a partir de células o tejido, aunque se puede utilizar cualquier solución acuosa como solución para realizar una inmunoprecipitación. Por lo general, el lisado se prepara a partir del tratamiento de las células o tejidos con algún tipo de detergente suave. El detergente suave resulta eficaz en la eliminación de las membranas, lo que interfiere con muchas interacciones intermoleculares débiles y libera la mayoría de los antígenos de la célula, sin alterar la conformación ni la actividad bioquímica de los antígenos de interés. Las interferencias causadas por las proteínas de unión no específicas se reducen al mínimo mediante el pretratamiento de la solución de antígeno con un anticuerpo que no se una al antígeno de interés con el fin de retirar las proteínas de unión no específicas.

Los inmunocomplejos se forman mediante la adición de anticuerpos específicos al lisado. Los 45 anticuerpos tienen una alta afinidad para sus respectivos antígenos, de manera que los complejos antígenoanticuerpo se forman rápidamente. Seguidamente, los complejos se purifican mediante la adición de una suspensión de microesferas de afinidad, tal como una suspensión de microesferas de proteína A o proteína G, a la solución que contiene los complejos antígeno-anticuerpo. La purificación se produce porque la proteína A y la proteína G tienen una alta afinidad por la región Fc del anticuerpo. Una vez que el complejo se ha unido a la microesfera a través de la 50 interacción proteína A/G-anticuerpo, las microesferas se recogen por centrifugación y las proteínas no unidas se retiraron por lavado de las microesferas. Las microesferas se pueden lavar mediante enjuague con una solución tal como tampón de lisis y retirada del lisado y del tampón de lavado por aspiración. Es importante la retirada completa del tampón de lavado con el fin de reducir el fondo y mejorar la eficacia del inmunoensayo. Una vez completada la formación y la purificación de los inmunocomplejos, las proteínas inmunoprecipitadas resultantes pueden ser objeto 55 de análisis adicionales. Con frecuencia, la siguiente etapa consiste en la separación de proteínas mediante SDS-PAGE.

Una desventaja importante de los procedimientos de arrastre molecular basado en la afinidad e inmunoprecipitación según se ponen en práctica de manera habitual es que la matriz de afinidad es difícil de

visualizar en los tubos utilizados en las etapas de formación y purificación del complejo. Esta dificultad en la visualización conduce a manipulaciones ineficientes y se traduce en la pérdida de material y la variabilidad cuantitativa de los resultados. Por ejemplo, las microesferas de agarosa o de poliacrilamida generalmente son no coloreadas, es decir, translúcidas o blancas, y son difíciles de visualizar en los tubos, lo que hace que las 5 manipulaciones durante el procedimiento resulten pesados. Debido a esta mala visibilidad, las microesferas se pueden perder durante la aspiración del sobrenadante de lisado durante el procedimiento de retirada de las proteínas no unidas. Además, es posible que se produzca la retirada accidental de las microesferas de agarosa o poliacrilamida de los tubos durante las etapas de lavado y aspiración como consecuencia de la mala visibilidad de las microesferas. Las dificultades e inexactitudes provocadas por la falta de visibilidad de las microesferas son las 10 principales limitaciones de los experimentos de arrastre molecular basado en la afinidad e inmunoprecipitación. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad sustancial de una adaptación que pueda mejorar la visibilidad de la matriz de afinidad sin alterar su funcionamiento en el procedimiento de arrastre molecular o inmunoprecipitación. Tal adaptación facilitaría en gran medida la manipulación de la matriz de afinidad para la persona encargada de realizar el procedimiento de arrastre molecular o inmunoprecipitación. La mejora de la manipulación se traduciría en una mayor eficiencia de las manipulaciones y reduciría la pérdida de material y la variabilidad cuantitativa de los resultados. En resumen, dicha adaptación mejoraría la eficiencia y la fiabilidad de afinidad de los procedimientos de arrastre molecular basado en la afinidad e inmunoprecipitación.

La afinidad de ciertos colorantes por las proteínas se conoce y utiliza desde hace algún tiempo en diversas aplicaciones. Desde hace mucho tiempo, los colorantes se utilizan como ligandos de afinidad para la purificación de proteínas en la cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad es un procedimiento que separa una sustancia de una mezcla en virtud del reconocimiento y la afinidad bioespecíficos (que implican interacciones no covalentes) de dicha sustancia por un ligando inmovilizado en un soporte. Los colorantes que se han utilizado para purificar proteínas fueron desarrollados originalmente para su aplicación en la industria textil.

Estos colorantes incluyen colorantes de triazina que se basan en la química del cloruro cianúrico (1, 3, 5triclorotriazina) . Los colorantes de triazina se han utilizado como ligandos para cromatografía de afinidad, ya que ofrecen ventajas en términos tanto de la preparación como del uso, en comparación con la opción más convencional de usar coenzima inmovilizada y diversos otros medios biológicos específicos de grupo. Entre estas ventajas se incluyen una capacidad de unión a proteínas que puede ser significativamente mayor que la de los medios bioespecíficos naturales, bajo coste, disponibilidad general y facilidad de preparación. Véase, por ejemplo, el documento de Christopher R. Lowe y James C. Pearson, Affinity Chromatography on Immobilized Dyes, Methods In Enzymology, Vol. 104, 97-113 (1984) .

La patente de EE. UU. n.º 5.597.485 describe un procedimiento para la separación de proteínas usando una composición polimérica que incluye un polímero formado a partir de al menos un monómero que contiene un radical polimerizable unido químicamente a un colorante orgánico aniónico sintético. El colorante tiene afinidad por la proteína que se desea separar. El procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Una matriz de afinidad para el aislamiento de una molécula a partir de una solución acuosa, comprendiendo la matriz de afinidad un soporte polimérico en partículas que contiene una mezcla de partículas, en donde una primera fracción de partículas de la mezcla tienen un colorante unido covalentemente para permitir la detección óptica de la soporte polimérico, y una segunda fracción de partículas de la mezcla tienen un ligando de afinidad distinto del colorante unido para la captura de la molécula, en donde ninguna de las partículas de la mezcla contiene tanto el colorante como el ligando de afinidad.

2. La matriz de afinidad de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la primera fracción de partículas comprende entre el 1 % y el 15 % en peso del soporte polimérico en partículas y la segunda fracción de partículas comprende entre el 85 % y el 99 % en peso del soporte polimérico en partículas.

3. La matriz de afinidad de una acuerdo cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en la que el colorante comprende un colorante que posee un cromóforo azo, un colorante que posee un cromóforo de antraquinona, o un colorante que posee un cromóforo de ftalocianina.

4. La matriz de afinidad de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el colorante se selecciona entre un grupo compuesto por ácido 5-