Polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los mismos.

Polipéptido aislado con actividad de celobiohidrolasa, seleccionado a partir de un polipéptido con al menos un 90%,

al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de la SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/036455.

Solicitante: NOVOZYMES, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1445 DREW AVENUE DAVIS, CA 95618 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: HARRIS, PAUL, LIU, YE, TANG,LAN, WU,WENPING.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/22 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Procesos que utilizan celulosa o sus hidrolizados o medios de cultivo que los contienen.
  • C12N15/113 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.
  • C12N9/42 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
  • C12P19/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Monosacáridos.
  • C12P19/14 C12P 19/00 […] › preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa.
  • C12P7/10 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › de un sustrato constituido por materias celulósicas.

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Fragmento de la descripción:

ES 2 534 078 T3

DESCRIPCIÓN Polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los mismos 5 Declaración de Derechos de Invenciones realizadas con la subvención del Gobierno Federal en materia de Investigación y Desarrollo [0001] Esta invención se llevó a cabo con el soporte del gobierno bajo el acuerdo de cooperación DE- FC36-08GO18080 10 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno posee ciertos derechos sobre la presente invención.

Referencia a un lista de secuencias

Esta solicitud contiene una Lista de Secuencias en un soporte legible por ordenador. 15

Referencia a un Depósito de Material Biológico

Esta solicitud contiene una referencia a un depósito de material biológico. 20 Antecedentes de la invención Campo de la invención [0004] La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican 25 los polipéptidos. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, y células huésped que comprenden los polinucleótidos así como a métodos de producción y utilización de los polipéptidos.

Descripción de las Técnicas Relacionadas

La celulosa es un polímero del azúcar simple glucosa enlazado por enlaces beta-1, 4. Existen muchos microorganismos que producen enzimas que hidrolizan los glucanos beta-enlazados. Estas enzimas incluyen las endoglucanasas, las celobiohidrolasas, y las beta-glucosidasas. Las endoglucanasas asimilan el polímero de celulosa en localizaciones aleatorias, dejándolo vulnerable a ataques por parte de las celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa hidrosoluble beta-1, 4-enlazado. Las beta-glucosidasas hidrolizan la celobiosa en glucosa.

La conversión de materias primas lignocelulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de que se evita la quema o el envío de los materiales a un vertedero, y el carácter no contaminante del combustible de etanol. Se consideraron la madera, los residuos agrícolas, los cultivos herbáceos y los residuos sólidos urbanos como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales consisten principalmente en celulosa, hemicelulosa, y lignina. Una vez que se ha convertido la celulosa en glucosa, se fermenta fácilmente la glucosa en etanol usando levaduras.

Liu y Li sometieron una celobiohidrolasa de la familia 6 de Chaetomium termophilum CT2 en el EMBL/GenBank

(UNIPROT: Q4JQF8) con una identidad del 74% y 75% al polipéptido maduro de la SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4 respectivamente. Zahri et al. sometieron una celobiohidrolasa II de Trichoderma parceramosum con una identidad del 64% y 65% al polipéptido maduro de la SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4 respectivamente.

WO 2004/056981 describe el aislamiento y caracterización de celobiohidrolasas de varios organismos, incluyendo 50 cepas de Thielavia en que las secuencias de nucleótido que codifican las celobiohidrolasas tienen hasta un 85% de identidad a la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3.

En la técnica hay la necesidad de mejorar las composiciones de proteína celulolítica a través de la suplementación con enzimas adicionales para aumentar la eficiencia y para proporcionar soluciones enzimáticas 55 rentables para la degradación de la lignocelulosa.

La presente invención proporciona polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Resumen de la invención

ES 2 534 078 T3

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de celobiohidrolasa seleccionados de un polipéptido con al menos un 90% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de la SEC ID nº 2 o de la SEC ID nº 4.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención; a células huésped recombinantes que comprenden los polinucleótidos; y a métodos de producción de los polipéptidos.

La presente invención también se refiere a métodos para degradar o convertir un material celulósico, que comprenden: tratar el material celulósico con una composición enzimática en presencia de un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa de la presente invención.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un producto de fermentación, que comprenden:

(a) sacarificar un material celulósico con una composición enzimática en presencia de un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa de la presente invención;

(b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o varios microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación; y

(c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

La presente invención también se refiere a métodos para la fermentación de un material celulósico, que comprenden: la fermentación del material celulósico con uno o varios microorganismos fermentadores, en la que se sacarifica el material celulósico con una composición enzimática en presencia de un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de un gen de celobiohidrolasa de la familia 6 de Thielavia hyrcaniae NN045097 (SEC ID nº 1 y 2, respectivamente) . La Figura 2 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de un gen de celobiohidrolasa de la familia 6 de Thielavia hyrcaniae NN045178 (SEC ID nº 3 y 4, respectivamente) . La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pCBHII45178. La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pGEM-T-CBHII45178. La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pCBHII45097. La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pGEM-T-CBHII45097. La Figura 7 muestra los perfiles de actividad pH de la Thielavia hyrcaniae NN045097 y de celobiohidrolasas NN045178 a 50º C. Las Figuras 8A y 8B muestran la estabilidad de las celobiohidrolasas de Thielavia hyrcaniae NN045097 y NN045178 como una función del pH a 50º C. La Figura 9 muestra los perfiles de actividad de temperatura de las celobiohidrolasas de Thielavia hyrcaniae NN045097 y NN045178 a pH 5. Las Figuras 10A y 10B muestran la estabilidad de las celobiohidrolasas de Thielavia hyrcaniae NN045097 y NN045178 como una función de la temperatura a pH 5.

Definiciones

Celobiohidrolasa: el término "celobiohidrolasa" significa una celobiohidrolasa 1, 4-beta-D-glucano (E.C. 3.2.1.91) , que cataliza la hidrólisis de enlaces 1, 4-beta-D-glucosídicos en la celulosa, en los celooligosacáridos, o en cualquier glucosa beta-1, 4-enlazada que contenga polímero, y libera celobiosa de los extremos reductores y no reductores de la cadena (Teeri, 1997, Cr y stalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167 ; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on cr y stalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178) . Para los propósitos de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa se determina según los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Se puede emplear el método de Lever et al. para evaluar la hidrólisis de la celulosa en rastrojo de maíz, mientras que se pueden utilizar los métodos de van Tilbeurgh et al. y de Tomme et al. para determinar la actividad de celobiohidrolasa en un derivado de disacárido fluorescente, 4metilumbeliferil-j-D-lactósido. Además, se puede usar la celulosa hinchada con ácido fosfórico (PASC por sus siglas en inglés) como un sustrato como se describe en el presente documento.

ES 2 534 078 T3

Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, y al menos un 100% de la actividad de celobiohidrolasa del polipéptido maduro de la SEC ID nº 2 o de la SEC ID nº 4.

Familia 6, GH6, o CEL6: los términos "Familia 6", "GH6" o "CEL6" se definen en el presente documento como un polipéptido que forma parte de la familia de glucósido hidrolasas 6, según Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido aislado con actividad de celobiohidrolasa, seleccionado a partir de un polipéptido con al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de la SEC ID nº 2 o SEC ID nº 4.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que es codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido pGEM-T-

CBHII45097 contenido en E. coli DSM 22598 o en el plásmido pGEM-T-CBHII45178 contenido en E. coli DSM 22599. 10

3. Composición que comprende el polipéptido según la reivindicación 1 o 2.

4. Polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2.

5. Célula huésped recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4 enlazado operativamente a una o varias secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido.

6. Método para producir un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa, que comprende: 20 (a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 5 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

7. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1 o 2. 25

8. Método para producir el polipéptido con actividad de celobiohidrolasa, que comprende:

(a) cultivar la planta transgénica o célula vegetal de la reivindicación 7 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y 30 (b) recuperar el polipéptido.

9. Método para degradar o convertir un material celulósico, que comprende: tratar el material celulósico con una composición enzimática en presencia del polipéptido con actividad de celobiohidrolasa de la reivindicación 1 o 2.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende además recuperar el material celulósico degradado.

11. Método para producir un producto de fermentación, que comprende:

(a) sacarificar un material celulósico con una composición enzimática en presencia del polipéptido con actividad de 40 celobiohidrolasa según la reivindicación 1 o 2;

(b) fermentar el material celulósico sacarificado con uno o varios microorganismos fermentadores para producir el producto de fermentación; y

(c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

12. Método de fermentación de un material celulósico, que comprende: fermentar el material celulósico con uno o varios microorganismos fermentadores, donde el material celulósico es sacarificado con una composición enzimática en presencia de un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa según la reivindicación 1 o 2.

13. Método según la reivindicación 12, donde la fermentación del material celulósico produce un producto de 50 fermentación.

14. Método según la reivindicación 13, que comprende además la recuperación del producto de fermentación de la fermentación.

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