Polinucleótido que comprende secuencias de gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante iARN.

La presente invención se refiere al silenciamiento específico delas α

(alfa), β (beta), γ (gamma) y ω (omega)-gliadinas de trigoduro y harinero mediante RNA de interferencia (ARNi) por medio del empleo de un polinucleótido que se transcribe a un hpRNA (hairpin RNA). Además, Ia presente invención también se refiere a un vector, célula, planta o semilla que comprenden el polinucleótido,cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretosde las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de Ia expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de γ-gliadinas o el promotor del gen que codifica para una D-hordeína.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/ES2010/070045.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: MARTIN MUÑOZ,ANTONIO, BARRO LOSADA,FRANCISCO, PISTON PISTON,FERNANDO, GIL HUMANES,JAVIER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01H5/10 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.A01H 5/00 Plantas con flores, es decir, angiospermas. › Granos.
  • C12N15/82 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.

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Fragmento de la descripción:

Polinucleótido que comprende secuencias de gliadinas de trigo y su uso para silenciamiento mediante iARN

La presente invención se refiere al silenciamiento específico de las a (alfa), (3 (beta), y (gamma) y w (omega)- gliadinas de trigo duro y harinero mediante ARN de interferencia (ARNi) por medio del empleo de un polinucleótido que se transcribe a un ARNh (ARN horquilla). Además, la presente invención también se refiere a un vector, célula, planta o semilla que comprenden el polinucleótido, cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretos de las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de la expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de y-gliadinas o el promotor del gen que codifica para una D-hordeína.

Estado de la técnica anterior

La interferencia de ARN (iARN) es un sistema de degradación del ARN mensajero mediado por ARN de doble cadena que permite el silenciamiento específico de determinados genes. Su descubriendo ha permitido el diseño de vectores compuestos de un promotor y señales de terminación, y entre ellos la secuencia del gen que se desea silenciar, en orientación sentido y antisentido, separados por una secuencia espadadora de longitud variable.

Los ARNip (de las siglas en inglés para ARN interferente pequeño o ARN interferente corto) son moléculas de ARN de doble hebra (ARNdh de las siglas en inglés para ARN de doble hebra) de 21-25 nucleótidos (nt), que se originan a partir de un ARNdh precursor más largo. Los ARNdh precursores pueden ser de origen endógeno, en cuyo caso se habla de miARN (codificados en el genoma del organismo) o de origen exógeno (como virus o transgenes). Tanto ARNip como miARN son dos tipos de ARNi (ARN de interferencia). El ARNi suprime la expresión post-transcripcional de un determinado ARNm (de las siglas en inglés para ARN mensajero) reconocidos por la secuencia de ARNi.

Cuando una célula recibe un ARNdh precursor (los ARN de hebra simple no producen este efecto), que puede generarse a partir de un transgén exógeno, un agente viral o un elemento genético propio, se fragmenta en ARNip por la acción de una enzima denominada Dicer, una enzima citoplásmica de la familia ARNasa III. Dicer corta el ARNdh en fragmentos de doble cadena de alrededor de 21-25 nucleótidos (ARNip), con el extremo 5 fosforilado y dos nucleótidos sobresaliendo, sin aparear, en el extremo 3. De las dos cadenas del ARNip solo una, denominada hebra guía, se incorpora en el complejo enzimático RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) mientras que la otra hebra se degrada. Las características termodinámicas del extremo 5 del ARNip determinan cuál de las dos hebras se incorpora al complejo RISC. Normalmente se incorpora como hebra guía aquella con menor estabilidad en el extremo 5, bien porque contenga un mayor contenido de bases AU o bien por apareamientos imperfectos. Para que se produzca el silenciamiento post-transcripcional la hebra guía debe ser complementaria al ARNm que se pretende silenciar. A continuación, el complejo RISC se une al ARNm complementario de la hebra guía del ARNip presente en el complejo y se produce el corte del ARNm. Posteriormente se produce la degradación de los fragmentos obtenidos. De esta manera, los ARNip provocan el silenciamiento post-transcripcional de las secuencias nucleotídicas diana, de forma que no se obtiene la proteína resultante de la expresión de estas secuencias.

En trigo, las proteínas del grano, aunque minoritarias (7-18 %) respecto a los hidratos de carbono (6-75 %), son fundamentales para las propiedades funcionales de la harina. Las principales proteínas del grano son las gluteninas y las gliadinas, que constituyen el gluten. Las gliadinas son responsables del desarrollo de la enfermedad celíaca ya que epítopos (determinantes antigénicos) reconocidos por las células T intestinales han sido identificados en regiones de a y y-gliadinas (Arentz-Hansen, et al., 22. Gastroenteroloqy 123:83-89). Las personas que sufren la enfermedad celíaca tienen intolerancia al gluten. La intolerancia al gluten se caracteriza por una inflamación crónica de la parte proximal del intestino delgado, causada por la exposición de gliadina. Mediante un trigo que tenga muy disminuido el contenido de gliadinas, se podría elaborar un alimento para celiacos.

Se conocen cuatro tipos de gliadina; a (alfa), p (beta), y (gamma) y co (omega). La supresión de gliadinas de granos de trigo empleando la tecnología de iARN se ha venido utilizando en los últimos años. Hasta la fecha, solamente se ha conseguido suprimir una parte de las gliadinas. Por ejemplo, mediante el empleo de construcciones genéticas que dan lugar a iARN de tipo horquilla, cuya estructura es: Promotor-Secuencia sentido-Espaciador-Secuencia antisentido-Terminador, se han conseguido eliminar gliadinas del tipo a (Folck et al., 25. XII International Conference on Plant Embryology. Oral presentation) o del tipo y (Gil-Humanes ef al. 28. Journal of Cereal Science 48(3):565-568), casi por completo, pero no se han conseguido eliminar todos los tipos de gliadinas de manera eficaz.

La obtención de plantas que tengan muy reducida la cantidad de gliadinas en sus semillas presenta dificultades técnicas como son, en primer lugar, el número elevado de genes que codifican para gliadinas y, en segundo lugar, que las plantas de trigo son hexaploides. Conseguir una transformación estable en las plantas de trigo presenta más dificultades que la transformación de cualquier otra planta con menor número de copias del genoma.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende dos pares de secuencias donde cada subsecuencia se combina en un orden determinado para dar lugar a una secuencia cuya transcripción a ARN sea capaz de originar un ARNh (ARN horquilla), es decir, un ARN en forma de horquilla, un ARN de doble hebra que será procesado por endorribonucleasas descritas en el estado de la técnica, por mediación de las cuales se generan los ARNip que producen el silenciamiento post-transcripcional de todos los ARNm (ARN mensajeros) que codifican para todos los tipos de gliadinas de trigo. Para ello, las cuatro subsecuencias son; la secuencia en orientación sentido de las co-gliadinas, la secuencia en orientación sentido de las a, p y y-gliadinas y las dos secuencias anteriores en orientación antisentido.

Mediante este polinucleótido, cuya expresión se dirige de forma específica en tejidos concretos de las semillas de trigo mediante secuencias reguladoras de la expresión génica como por ejemplo, el promotor de un gen de y- gliadinas o el promotor del gen que codifica para una D-hordeína, se consigue el silenciamiento post-transcripcional de todos los genes de especies de trigo blando y de especies de trigo duro de manera eficaz y sinérgica, ya que se consiguen silenciar más cantidad de genes de gliadinas cuando se comparan con los resultados de silenciamiento de a y y-gliadinas mediante ARNh que se describen en el estado de la técnica. Ello se debe fundamentalmente al diseño específico de las subsecuencias en orientación sentido y antisentido cuyos ARNip generados hibridan con todos los ARNm de las a, (3, y y oo-gliadinas de trigo en combinación con promotores de las gliadinas con niveles de expresión más elevados, inducibles en tejidos específicos de la semilla de trigo. Este diseño se ha llevado a cabo mediante la identificación de grupos de gliadinas que contienen epítopos reconocidos por las células T humanas, de modo que el silenciamiento de las proteínas que los contienen da lugar a semillas de trigo con las que se pueden obtener productos aptos para personas que presentan alergia al gluten.

En la presente invención se emplean los términos ADN o ARN para referirse al ácido desoxirribonucleico o al ácido desoxirribonucleico respectivamente.

En este sentido, un aspecto de la presente invención es un polinucleótido que comprende dos pares de secuencias (a1 -a2) y (b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora donde:

a. las secuencias a1, a2, b1 y b2 son diferentes entre sí y se seleccionan de entre SEC ID N2 1, SEC ID N9 2, SEC ID N2 3 o SEC ID N2 4, de la siguiente forma:

b. si a1 es SEC ID N21 o SEC ID N2 4, b1 es SEC ID N2 4 o SEC ID N21 y a2 es SEC ID N2 2 o SEC ID N2 3, y

c. si a1 es SEC ID N2 2 o SEC ID N2 3, b1 es SEC ID N2 3 o SEC ID N2 2 y a2 es SEC ID N21 o SEC ID N2 4.

Otro aspecto de la presente invención es un polinucleótido que comprende dos pares de secuencias (a1-a2) y (b2- b1) separadas por una secuencia espaciadora donde las secuencias a1, a2, b1 y b2 se describen en los apartados (a) a (c) del aspecto anterior.

Las secuencias a1-a2 y b2-b1 (en adelante, pares de secuencias de la invención),... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polinucleótido que comprende dos pares de secuencias (a1-a2) y (b2-b1) separadas por una secuencia espaciadora en el que:

a. las secuencias a1, a2, b1 y b2 son diferentes entre sí y se seleccionan entre SEC ID N2 1, SEC ID N2 2, SEC ID N2 3 o SEC ID N2 4, de la siguiente forma:

b. si a1 es SEC ID N21 o SEC ID N2 4, b1 es SEC ID N2 4 o SEC ID N21 y a2 es SEC ID N2 2 o SEC ID N2 3, y

c. si a1 es SEC ID N2 2 o SEC ID N2 3, b1 es SEC ID N2 3 o SEC ID N2 2 y a2 es SEC ID N21 o SEC ID N2 4.

2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en que a1 es SEC ID N2 1, a2 es SEC ID N2 2, b2 es SEC ID Ne 3 y b1 es SEC ID N2 4.

3. El polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en que la secuencia espaciadora es SEC ID N2 5.

4. El polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que además comprende una secuencia reguladora de la expresión génica unida funcionalmente a su extremo 5'.

5. El polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que la secuencia reguladora de la expresión génica es SEC ID N2 6 y/o SEC ID N2 7.

6. Una secuencia de ARN codificada por el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, capaz de formar un ARNh en que la secuencia codificada por el par a1-a2 híbrida completamente con la secuencia codificada por el par b2-b1.

7. Un ARNip generado a partir de la secuencia del ARNh de acuerdo con la reivindicación 7.

8. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Una célula aislada transfectada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8.

1. Una planta modificada genéticamente en donde dicha planta comprende la célula transfectada de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una planta modificada genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polinucleótido está integrado en una forma estable.

12. La planta de acuerdo la reivindicación 11, en donde dicha planta pertenece al género Triticum.

13. La planta de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha planta se selecciona entre las especies Triticum aestivum o Triticum turgidum.

14. La planta de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha planta es un cultivar Bobwhite o un cultivar Don Pedro.

15. Una semilla derivada de la planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde dicha semilla comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. El polen, el propágulo, la progenie o parte de la planta derivada de cualquiera de las plantas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde dichos polen, propágulo, progenie o parte comprenden el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

17. El uso del polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un vector de acuerdo con la reivindicación 9 o célula de acuerdo con la reivindicación 1 para el silenciamiento de alfa, beta, gamma y omega gliadinas de Triticum spp.

18. El uso de la semilla de acuerdo con la reivindicación 15 para la preparación de harina, una composición alimenticia, una vitamina o un suplemento nutricional.

19. Una composición alimenticia preparada a partir de la semilla de acuerdo con la reivindicación 15.

2. Un método para la obtención de la planta modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende lo siguiente:

a. seleccionar una parte de la planta,

b. transfectar las células de la parte de la planta del apartado (a) con el vector de acuerdo con la reivindicación 9,

c. seleccionar la célula transfectada del apartado (b) que comprende el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

d. regenerar al menos una planta procedente de la célula seleccionada en el apartado (c),

e. seleccionar una o varias plantas regeneradas de acuerdo con el apartado (d) en las que el polinucleótido se

transcribe en un ARNh,

f. seleccionar una o más plantas obtenidas de acuerdo con el apartado (e) que presentan silenciamiento de las alfa, beta, gamma y omega gliadinas en sus semillas.

21. Un método para producir una composición alimenticia con contenido reducido de gliadina que comprende

producir una planta transgénica de trigo con contenido reducido de gliadina que comprende integrar el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el genoma de una planta y silenciar las alfa, beta, gamma y omega gliadinas en las semillas de dicha planta, producir semillas a partir de dicha planta en que las alfa, beta, gamma y omega gliadinas están silenciadas y preparar una composición alimenticia a partir de dichas semillas.

22. Una secuencia de ácido nucleico aislada correspondiente al promotor del gen para gamma gliadinas definido en SEC ID N2 6.


 

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