Plantas con producción de hialuronano aumentada.

Una célula vegetal modificada genéticamente que tiene una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa integrada de manera estable en su genoma,

teniendo dicha célula vegetal además una molécula de ácido nucleico foránea integrada de manera estable en su genoma, codificando dicha molécula de ácido nucleico foránea una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) y teniendo la célula vegetal una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente.

de ias secuencias

SECIDN°1: Secuencia de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa del Virus 1 de

Paramec/um óursar/a de C/r/ore/Za.

SEC ID N° 2: Secuencia de ácido nucleico de una hialuronano sintasa del Virus 1 de Paramec/um

ótrrsana de C/?/ore//a. La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEC ID N°1.

SEC ID N° 3: Secuencia de ácido nucleico sintética que codifica una hialuronano sintasa del Virus 1 de

Paramecrum óursar/a de Ch/ore//a. La síntesis de los codones de la secuencia mostrada se llevó a cabo de manera que se adaptara al uso de los codones en las células vegetales. La secuencia de ácido nucleico mostrada codifica una proteina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 2.

SEC ID N° 4: Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de una GFAT-

1 del ratón.

SEC ID N° 5: Secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene la actividad de una GFAT-1 del ratón.

La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEC ID N° 4.

SEC ID N°6: SEC ID N°7: SEC ID N°8: SEC ID N°9: SEC ID N° 10:

SEC ID N° 11: SEC ID N° 12: SEC ID N° 13: SEC ID N° 14:

Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina que tiene la actividad de una GFAT- 2 del ratón.

Secuencia de aminoácidos de una proteina que tiene la actividad de una GFAT-2 del ratón. La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEC ID N° 6.

Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina que tiene la actividad de una GFAT de Esc/7er/c/7/a co//.

Secuencia de aminoácidos de una proteina que tiene la actividad de una GFAT de Esc/7er/c/7/a co//. La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEC ID N° 8.

Secuencia de ácido nucleico sintética que codifica una proteina que tiene la actividad de una GFAT de Esc/7er/c/7/a co//. La síntesis de los codones de la secuencia mostrada se llevó a cabo de manera que se adaptara al uso de codones en células vegetales. La secuencia de ácido nucleico mostrada codifica una proteina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 9.

Ollgonucleótldo sintético usado en el Ejemplo 1.

Ollgonucleótldo sintético usado en el Ejemplo 1.

Ollgonucleótldo sintético usado como cebador de PCR en el Ejemplo 10.

Ollgonucleótldo sintético usado como cebador de PCR en el Ejemplo 10.

Toda la literatura citada, Incluyendo, pero sin limitación, los números de acceso de las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos se Incorporan en la descripción a modo de referencia.

Descripción de ¡as figuras

Flg. 1: Muestra una curva de calibración y la ecuación correspondiente de la línea de regresión usada para

calcular el contenido de hlaluronano del tejido vegetal. La curva de calibración se estableció con ayuda del kit de ensayo comercial (kit de ensayo de ácido hialurónico (HA) de Corgenix Inc., Colorado, EE.UU., N° de prod. 029-001) y las soluciones patrón suministradas con el mismo.

5 Procedimientos generaies

A continuación, se describen los procedimientos que se pueden usar en relación con la presente invención. Estos procedimientos son realizaciones especificas. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos procedimientos. El experto en la materia sabe que la invención se puede llevar a cabo de la misma manera mediante la modificación de los procedimientos descritos y/o mediante el reemplazo de procedimientos individuales o partes 10 de procedimientos por procedimientos alternativos o partes alternativas de procedimientos.

1. Transformación de plantas de patata

Se transformaron plantas de patata con ayuda de Agrobacfenum, como se describe en Rocha-Sosa ef a/. (EMBO J.

8, (1989), 23-29).

2. Aislamiento de hialuronano de tejido vegetal

15 Para detectar la presencia de hialuronano y determinar el contenido de hialuronano en tejido vegetal, se trató material vegetal de la siguiente manera: se añadieron 200 pl de agua (desmineralizada, conductividad >18 MG) a aproximadamente 0,3 g de material, y se trituró la mezcla en un molino de bolas oscilatorias de laboratorio (MM200, de Retsch, Alemania, 30 segundos a 30 Hz). A continuación, se añadieron otros 800 pl de agua (desmineralizada, conductividad >18 MG), y se mezcló bien la mezcla (usando, por ejemplo, un mezclador Vortex). Se separaron los 20 restos celulares y los componentes insolubles del sobrenadante por centrifugación a 16.000 xg durante 5 minutos.

3. Purificación del hialuronano

Se pelaron aproximadamente 100 gramos de tubérculos, se cortaron en trozos de un tamaño de aproximadamente 1 cm^ y, tras la adición de 100 mi de agua (desmineralizada, conductividad >18 MG), se trituraron en un mezclador Warrlng a velocidad máxima durante unos 30 segundos. A continuación, se retiraron los restos celulares usando un 25 tamiz de té. Se volvieron a suspender los restos celulares que se habían retirado en 300 mi de agua (desmlneralizada, conductividad >18 MG) y se retiraron de nuevo usando un tamiz de té. Se combinaron las dos suspensiones obtenidas (100 mi + 300 mi) y se centrifugaron a 13.000 xg durante 15 minutos. Se añadió NaCI al sobrenadante de centrifugación obtenido hasta que se alcanzó una concentración final del 1 %. Lina vez que el NaCI

se hubo pasado a la disolución, se llevó a cabo la precipitación mediante la adición de dos veces el volumen de etanol, tras lo que se mezcló bien y se incubó a -20 °C durante una noche. Después, se centrifugó la mezcla a 13.000 xg durante 15 minutos. Se disolvió el precipitado sedimentado obtenido tras esta centrifugación en 100 mi de tampón (TrisHCI 50 mM, pH 8, CaC¡21 mM) y, a continuación, se añadió proteinasa K a una concentración final de 100 pg/ml y se incubó la solución a 42 °C durante 2 horas. A esto, le siguieron 10 minutos de incubación a 95 °C. Una vez más, se añadió NaCI a esta solución hasta que se alcanzó una concentración final del 1 %. Una vez que el NaCI se hubo pasado a la disolución, se llevó a cabo otra precipitación mediante la adición de dos veces el volumen de etanol, se mezcló bien y se incubó a -20 °C durante aproximadamente 96 horas. A esto, le siguieron 15 minutos de centrifugación a 13.000 xg. Se disolvió el precipitado sedimentado obtenido tras esta centrifugación en 30 mi de agua (desmineralizada, conductividad > 18 MO), y una vez más, se añadió NaCI a una concentración final del 1 %. Mediante la adición de dos veces el volumen de etanol, mezclando bien e incubando a -20 °C durante una noche, se llevó a cabo otra precipitación. Se disolvió el precipitado obtenido tras la posterior centrifugación a 13.000 xg durante 15 minutos en 20 mi de agua (desmineralizada, conductividad > 18 MO). Se llevó a cabo una purificación adicional por filtración centrífuga. Con este fin, en cada caso, se aplicaron 5 mi de precipitado disuelto a un filtro de membrana (CentñconAmicon, ancho de poro de 10.00 NMWL, N° de prod. UCF8 010 96), y se centrifugó la muestra a 2.200 xg hasta que solo quedaron aproximadamente 3 mi de la solución encima del filtro. Dos veces más, se añadieron entonces en cada caso 3 mi de agua (desmineralizada, conductividad > 18 MO) a la solución sobre la membrana y, en cada caso, se volvió a centrifugar en condiciones idénticas hasta que, al final, solo quedaron aproximadamente 3 mi de la solución encima del filtro. Se extrajeron las soluciones todavía presentes sobre la membrana tras la filtración centrífuga, y se enjuagó la membrana varias veces (de tres a cinco veces) con aproximadamente 1,5 mi de agua (desmineralizada, conductividad > 18 MO). Se combinaron todas las soluciones que todavía estaban presentes encima de la membrana y las soluciones obtenidas del enjuague, se añadió NaCI hasta una concentración final del 1 %, y una vez que el NaCI se hubo pasado a la disolución, se añadió el doble de volumen de etanol, se mezcló la muestra y se obtuvo un precipitado mediante el almacenamiento a -20 °C durante una noche. Se disolvió el precipitado obtenido tras la posterior centrifugación a 13.000 xg durante 15 minutos en 4 mi de agua (desmineralizada, conductividad > 18 MO) y luego se liofilizó (24 horas bajo una presión de 0,037 kPa, aparato de liofilización Cristo Alfa 1-4 de Chñst, Osterode, Alemania).

4. Detección de hialuronano y determinación del contenido de hialuronano

Se detectó hialuronano usando un kit de ensayo comercial (kit de ensayo de ácido hialurónico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado, EE UU., N° de prod. 029-001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante que se incorporan en la presente descripción... [Seguir leyendo]

1. Una célula vegetal modificada genéticamente que tiene una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa integrada de manera estable en su genoma, teniendo dicha célula vegetal además una molécula de ácido nucleico foránea integrada de manera estable en su genoma, codificando dicha molécula de ácido nucleico foránea una proteina que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) y teniendo la célula vegetal una actividad aumentada de una proteina que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente.

2. La célula vegetal modificada genéticamente según lo reivindicado en la reivindicación 1 que sintetiza una cantidad aumentada de hialuronano en comparación con las células vegetales que tienen la actividad de una hialuronano sintasa y no tienen actividad aumentada de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFTA).

3. Una planta que comprende células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Material de propagación de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 3 que comprende células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

5. Partes vegetales cosechables de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 3 que comprenden células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

6. Un procedimiento de producción de una planta que sintetiza hialuronano que comprende:

a) modificar genéticamente una célula vegetal, comprendiendo la modificación genética las siguientes etapas i a ¡i:

i) la introducción de una molécula de ácido nucleico foránea que codifica una hialuronano sintasa en la célula vegetal;

¡i) la introducción de una modificación genética en la célula vegetal que da lugar a un aumento de la actividad de una proteina que tiene la actividad enzimàtica de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente; en el que la modificación genética es la introducción de una molécula de ácido nucleico foránea que codifica una proteina que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) en la célula vegetal,

en el que las etapas ¡ a ¡i se pueden llevar a cabo en cualquier orden, individualmente, o se puede llevar a cabo cualquier combinación de las etapas i a ii simultáneamente;

b) regenerar una planta a partir de células vegetales de la etapa a);

en el que, si es apropiado, las células vegetales se aíslan de plantas obtenidas de acuerdo con la etapa b) i o b) ¡i, y las etapas a) a b) del procedimiento se repiten hasta que se genera una planta que tiene una molécula de ácido nucleico foránea que codifica una hialuronano sintasa y que tiene una actividad aumentada de una proteina que tiene la actividad enzimàtica de una GFAT en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente.

7. Un procedimiento de preparación de hialuronano que comprende la etapa de extraer hialuronano de células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 3, de material de propagación según lo reivindicado en la reivindicación 4, de partes cosechables de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 5 o de plantas que se pueden obtener mediante el procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 6.

8. Uso de una célula vegetal modificada genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, una planta según lo reivindicado en la reivindicación 3, material de propagación según lo reivindicado en la reivindicación 4, partes cosechables de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 5 o de plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 6 de preparación de hialuronano.

9. Una composición que comprende células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y que comprende moléculas de ácidos nucleicos recombinantes caracterizadas porque las moléculas de ácidos nucleicos comprenden moléculas de ácidos nucleicos que codifican una hialuronano sintasa y proteínas que tienen la actividad de una glutam¡na:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT).

10. Un procedimiento de preparación de una composición que comprende hialuronano, en el que se usan células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, plantas según lo reivindicado en la reivindicación 3, material de propagación según lo reivindicado en la reivindicación 4, partes cosechables de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 5 o plantas que se pueden obtener

mediante un procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 6.

11. El uso de células vegetales modificadas genéticamente según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 3, de material de propagación según lo reivindicado en la reivindicación 4, de partes cosechables de plantas según lo reivindicado en la reivindicación 5 o de

5 plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento según lo reivindicado en la reivindicación 6 para la preparación de una composición según lo reivindicado en la reivindicación 9.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende una etapa adicional c) en la que se regeneran plantas adicionales mediante propagación vegetativa usando las plantas de la etapa b).