Péptidos citrulinados de histonas y usos de los mismos.

Un péptido caracterizado por

- ser antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y

- consistir en,

desde el extremo amino al carboxílico, la secuencia de aminoácidos:

S G X1 G K G G K G L G K G G A K X2 H X3 K (del aa 1 al aa 20 de la SEC ID Nº 1), G A K X2 H X3 K V L X4 D N I Q G I T K P A I (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID Nº 1) o K P A I X5 X6 LA X7 X8 G G V K X9 I S G L I (del aa 31 al aa 50 de la SEC ID Nº 1) en donde los aminoácidos X1-X9 se seleccionan de forma independiente de un resto de arginina o un resto de citrulina y al menos dos de X1-X9 son un resto de citrulina, o un fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina, siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de artritis reumatoide.

Péptidos citrulinados de histonas y usos de los mismos Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos sintéticos citrulinados derivados de la proteína histona H4 y a su uso en el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias, en particular artritis reumatoide (AR).

Estado de la técnica

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad articular inflamatoria caracterizada por un mecanismo autoinmunitario medida por los linfocitos tanto T como B. En los fluidos biológicos de los pacientes con AR se pueden detectar diferentes autoanticuerpos. Algunos de estos autoanticuerpos se pueden usar para el diagnóstico y seguimiento de la AR.

El biomarcador de la AR mejor conocido es el factor reumatoide (FR), una clase de anticuerpos IgG o IgM dirigidos contra la región Fe del isotipo IgG de inmunoglobulinas. No obstante, el FR no es un marcador específico de la AR ya que también se puede encontrar otras afecciones patológicas y en individuos sanos ancianos. El descubrimiento de la implicación de los epítopos citrulinados (cit) en la AR usando los anticuerpos anti-factor perinuclear y anti- queratina reforzaron la identificación de nuevos biomarcadores altamente específicos de la AR. Se han usado diferentes proteínas y péptidos citrulinados para desarrollar ensayos diagnósticos específicos y sensibles, lo que permite reconocer los autoanticuerpos frente a la AR, lo que generalmente se denominan anticuerpos anti-péptido citrulinado (PC) (AAPC) [documentos US22143143, US278738, EP194619, US2714874, W297846, W2977, W2717556, EP1456662, W199928344, W28132264], Entre todas las proteínas asociadas con la AR, las siguientes secuencias citrulinadas se han usado en ensayos diagnósticos: fibrina [C. Masson-Bessiére et al. J. Immunol. 21, 166, 4177], colágeno II [H. Burkhardt et al. Eur. J. Immunol. 25, 35, 1643], vimentina [E.R. Vossenaar et al. Arthritis Rheum. 24, 5, 3485], filagrina [documentos US2928885, US744593, US68972] y proteínas virales [C. Anzilotti et al. J. Rheumatol. 26, 33, 647; W2487747],

La sensibilidad de las pruebas se incrementó mediante el uso de péptidos citrulinados cíclicos sintéticos derivado de filagrina (PCC) [G.A. Schellekens et al. J. Clin. Invest. 1998, 11, 273] [documento W19982253] caracterizados por una estructura que expone óptimamente las citrulinas a la unión del anticuerpo. En la actualidad se han desarrollado tres generaciones de pruebas con PCC: PCC1 (sensibilidad 68 %, especificidad 98 %) [G.A. Schellekens et al. Arthritis Rheum. 2, 43, 155], PCC2 (intervalo de sensibilidad 39-94%, intervalo de especificidad 81-1%) [J. Avouac et al. Ann. Rheum. Dis. 26, 65, 845], y PCC3 (intervalo de sensibilidad 51- 83 %, intervalo de especificidad 93-98 %) [L. Lutteri et al. Clin. Chim. Acta 27, 386, 76], Estos ELISA diagnósticos de la AR están disponibles comercialmente (Euro-Diagnostica, Arnhem, Países Bajos; Axis-Shield, Dundee, Scotland; INOVA, San Diego, EE.UU.).

Recientemente, el uso de secuencias citrulinadas derivadas de las proteínas EBNA-1 (VCP1) y EBNA-2 (VCP2) del virus de Epstein-Barr ha permitido el desarrollo de ensayos diagnósticos caracterizados por especificidades y sensibilidades comparables a las indicadas para las pruebas PCC2 y PCC3 [F. Pratesi et al. Arthritis Rheum. 26, 54, 733; C. Anzilotti et al. J. Rheumatol. 26, 33, 647; documento W2487747; documento EP91767764]. Es interesante el hecho de que la comparación de los rendimientos de las pruebas basadas en PCC2, PCC3, PCC1, y VCP2 sugirió que secuencias citrulinadas diferentes pueden detectar diferentes subgrupos de anticuerpos anti-PC en el mismo grupo de pacientes. Estos resultados confirmaron el papel importante de la secuencia de aminoácidos que rodea a los residuos de citrulina en la formación de epítopos anti-PC, en contraste con el hipotético papel excluido de la unidad XG o XnonG (X= citrulina) [documento EP1693673],

Otra clase de proteínas asociadas con otras enfermedades autoinmunitarias pero todavía no directamente relacionadas con el diagnóstico de la AR está representada por las proteínas histonas. Las histonas son constituyentes de los nucleosomas y se clasifican en seis clases: H1, H2A, H2B, H3, H4 y H5. Las secuencias derivadas de H1 y H2B se usaron para detectar autoanticuerpos en el lupus eritematoso sistémico, la AR y la esclerosis sistémica [documento W34454]. Incluso si se sabe que estas proteínas están desimanadas de forma nativa y generalmente modificadas [K. Arita et al. PNAS 26, 13, 5291; A.J.W. Zendman et al. Anal. Biochem. 27, 369, 232], hasta ahora ninguna secuencia citrulinada de histona se ha asociado con la AR. No obstante se han descrito micromatrices basadas en el uso de histonas modificadas (es decir, fosforiladas, metiladas, acetiladas y ubiquitinadas), pero no citrulinadas, para la detección de anticuerpos [documento WO7132177]. Osborne et al. [Biochemistry, 27, 46(46), 1337-13381] describen la síntesis química de fragmento de la histona H4 (1 - 21) que tiene un residuo de citrulina en las posiciones 17 y 29 para estudios enzimáticos.

Wysocka et al. [Frontiers in Bioscience, 26, 11, 344-355] divulgan que a histona H4 está citrulinada in vivo únicamente en la posición 3 y que tiene residuos de citrulina en las posiciones 3, 17 y 19, obtenible mediante desaminación in vitro.

Hagiwara et al. [Biochemistry, 25, 44(15), 5827-5834] divulgan que el fragmento (1-23) y (1-5) de la histona H4 que tienen Cit en la posición 3.

El documento WO 29114721 divulga agentes de unión, tales como anticuerpos que se unen específicamente a péptidos citrulinados, incluida la histona H4 citrulinada enzimáticamente. Estos agentes de unión se usan en la prevención o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, en particular la AR.

El documento WO21/117694 divulga una secuencia que es una combinación de fragmentos de la histona H4 que comprenden un residuo de citrulina en las posiciones 23 y 95.

El documento WO 24/7898 divulga un péptido no relacionado con las proteínas histonas y que consiste principalmente en residuos de citrulina.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a péptidos sintéticos citrulinados derivados de la proteína histona del núcleo H4 y a su uso en el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias, en particular AR. La investigación del papel de la desaminación de las histonas en la AR condujo a la definición de una serie de secuencias citrulinadas derivadas de H4. Dichas secuencias pueden reconocer autoanticuerpos específicos de la AR. Los péptidos citrulinados de acuerdo con la invención derivan de la secuencia de aminoácidos de la H4 humana, en particular de la secuencia comprendida entre el aminoácido (aa) 1 al aa 5 (Swiss-Prot P6285 aa 2 al aa 51) de dicha secuencia.

Por tanto, es un objeto de la invención un péptido caracterizado por

ser antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide y

consistir en, desde el extremo amino al carboxílico, de la secuencia de aminoácidos: SGXiGKGGKGLGKGGAKX2HX3K(aa 1 al aa 2 de la SEC ID N21), G AKX2HX3KVLX4DNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID N21) o K PAIXsXsLAXyXsGGVKXgISGLI (del aa 31 al aa 5 de la SEC ID N21) en las que los aminoácidos X1-X9 se seleccionan de forma independiente de un resto de arginina o un resto de citrulina y al menos dos de X1-X9 son un resto de citrulina, o un fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina, siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide.

Se demostró que los péptidos como se describen en la invención y que poseen al menos dos restos de citrulina eran muy adecuados para el diagnóstico específico de la AR. Las secuencias peptídicas más cortas que comprenden al menos siete restos de aa y derivadas de H4(1-5) (Fórmula I) son de particular interés.

Preferentemente, el péptido es un fragmento funcional de la SEC ID N2 1 y consiste en la secuencia seleccionada del grupo de G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID N2 1 en el que X2-X4 son restos de citrulina (Cit)), K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I (del aa 31 al aa 5 de la SEC ID N21 en el que X5-X9 son restos de citrulina (Cit)) o un fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide.

Preferentemente, el péptido como se ha indicado anteriormente está en forma lineal o en forma... [Seguir leyendo]

1. Un péptido caracterizado por

- ser antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis

reumatoide y

- consistir en, desde el extremo amino al carboxílico, la secuencia de aminoácidos:

SGX1GKGGKGLGKGGAKX2HX3K (del aa 1 al aa 2 de la SEC ID Ng 1), G A K X2 H X3 K V L X4DNIQGITKPAI (del aa 14 al aa 34 de la SEC ID H°-1) o K P A I X5 X6 LA X7 X8 G G V K X91 S G L I (del aa 31 al aa 5 de la SEC ID NQ 1) en donde los aminoácidos Xi-Xg se seleccionan de forma independiente de un resto de arginina o un resto de citrulina y al menos dos de Xi-Xg son un resto de citrulina, o un fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina, siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de artritis reumatoide.

2. El péptido de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia seleccionada del grupo de G A K Cit H Crt K V L Cit D N I Q G I T K P A I (aa 14 al aa 34 de SEC ID NQ1 en la que X2-X4 son restos de citrulina (Cit)), K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I (del aa 31 al aa 5 de la SEC ID NQ1 en donde X5-Xg son restos de citrulina (Cit)) o fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina, siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide.

3. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es de forma lineal.

4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en forma de péptido multimérico ramificado.

5. El péptido de la reivindicación 4 que comprende cuatro copias idénticas del péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2.

6. El péptido de la reivindicación 5, seleccionado del grupo de:

(S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K)4 K2 K betaA.

S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit

S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit Y*r \

KbetaA

S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K\ /

S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit Ys

»

(G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A l)4 K2 K betaA,

G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G

G A K Cít H Cit K V L Cit D N i Q G G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G

G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G O

(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L l)4 K2 K betaA,

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I v K P A i Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I ^ \

KbetaA

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I v. /

>

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L K

en la que Cit es un resto de citrulina y betaA es un resto de beta-alanina.

ITKPAU

ITKP Al- ITKPAU

ITKPAI

\

KbetaA

/

7. Un método para el diagnóstico de artritis reumatoide en un sujeto, que comprende la etapa de detectar anticuerpos específicos de la artritis reumatoide en una muestra biológica

- haciendo reaccionar en las condiciones adecuadas dicha muestra biológica con al menos un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para producir un complejo;

- detectar el complejo.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la muestra biológica se hace reaccionar con el péptido que comprende la secuencia (G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A l)4 K2 K betaA,

G A K Cit H Cit K V L Cit O N I Q G I T K P A l>

G A K Cit H Cit K V L Cit N I Q G IT K P AI' G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A K

G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I'

y el péptido que comprende la secuencia

(K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L l)4 K2 K betaA,

K P AI Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L k

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I " K R A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L K

\

KbetaA /

\

KbetaA

/

K

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit 1 S G L r en la que Cit es un resto de citrulina y betaA es un resto de beta-alanina.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 que es un ensayo inmunológico.

1. Un kit para el diagnóstico de artritis reumatoide que comprende al menos un péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un fragmento funcional del mismo que tiene una longitud de al menos 7 aminoácidos y que comprende al menos dos restos de citrulina, siendo dicho fragmento funcional antigénicamente eficaz y capaz de unirse específicamente a los anticuerpos específicos de artritis reumatoide, en donde dicho kit detecta anticuerpos específicos de artritis reumatoide.

11. El kit de la reivindicación 1, que comprende el péptido que comprende la secuencia (G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A l)4 K2 K betaA,

G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A K

GAKCitHCitKVLCitDN I Q G I T K P A I"'"' \

G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A K /

>

G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A K y el péptido que comprende la secuencia

(K P A I Cit Cit LA Cit Cit G G V K Cit I S G L l)4 K2 K betaA,

KbetaA

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I.

K

K P AI Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit l S G L I \

KbetaA

K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit l S G L K /

K P A i Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L r

en la que Cit es un resto de citrulina y betaA es un resto de beta-alanina.

12. Un anticuerpo dirigido contra el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en ensayos diagnósticos para artritis reumatoide.