Nuevo biomaterial procedente de gelatina de Wharton de cordón umbilical.

Un biomaterial en forma de un hidrogel inyectable,

que comprende un extracto de gelatina de Wharton del cordon umbilical de animales (no humanos),

caracterizado por que:

- dicho extracto consiste en la mezcla de glicosaminoglicanos (GAG) presentes en el cordon umbilical, que consiste en acido hialuronico, sulfato de queratano, 6-sulfato de condroitina, sulfato de heparano, 4-sulfato de condroitina, sulfato de dermatano y heparina, y

- dicho extracto carece de membrana de cordon umbilical, de vasos sanguineos y de celulas o de restos de celulas, tal como se presentan originalmente en la gelatina de Wharton.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un biomaterial, específicamente un hidrogel, formado a partir de la matriz extracelular del cordón umbilical para su aplicación en medicina regenerativa. La invención se refiere particularmente a un biomaterial compuesto esencialmente por los glicosaminoglicanos presentes exclusivamente en la gelatina de Wharton (GW) del cordón umbilical, y también a los métodos para la producción y el uso del mismo. Las realizaciones del producto pueden usarse individualmente o en combinación con terapias basadas en células.

Antecedentes de la invención

Los biomateriales formados por polímeros desempeñan un papel fundamental en la medicina regenerativa puesto que proporcionan anclajes tridimensionales temporales para la adhesión, proliferación y la diferenciación de células trasplantadas. Esta estructura tridimensional proporciona una plataforma adecuada para la comunicación intercelular y la relación de las células con los componentes del biomaterial. La biointeracción que se produce entre la matriz y las células con el tiempo determina la capacidad proliferativa de las células, su organización para la formación de un nuevo tejido, su diferenciación y la secreción de moléculas de señalización que dirigen el proceso regenerativo (Dawson etal., 2008).

Con el fin de que se produzcan estos fenómenos, es necesario que el biomaterial permanezca en el sitio de aplicación durante un tiempo limitado hasta su reabsorción, conservando su estructura durante el tiempo suficiente para una acción celular adecuada con consecuencias regenerativas.

Los hidrogeles, un tipo específico de biomaterial, tienen varias propiedades que los hacen adecuados para su aplicación en la ingeniería de tejidos.

Los hidrogeles son estructuras formadas por polímeros hidrófilos interconectados de una naturaleza sintética o natural, con la capacidad para contener una gran cantidad de agua dentro de su estructura, desde el 10-20% hasta cientos de veces su propio peso. Estos geles muestran una morfología semisólida con una red tridimensional que es un candidato ideal para formar una matriz estructural que puede actuar como soporte. Esta estructura tridimensional puede formarse tanto mediante reticulación física como mediante reticulación química. La reticulación física conduce a hidrogeles reversibles cuya estructura puede invertirse según la aplicación final, mientras que la reticulación química covalente conduce a hidrogeles permanentes, cuya estructura se mantendrá a través de toda la aplicación (Coburn et al., 2007). Por tanto, los hidrogeles son materiales poliméricos (de una naturaleza sintética o natural) reticulados en forma de una red tridimensional que se hincha en contacto con agua, formando materiales elásticos blandos, y que retienen una fracción significativa de la misma en su estructura sin disolverse.

Los hidrogeles tienen una serie de características particulares, tales como:

1. Naturaleza hidrófila: debido a la presencia en su estructura de grupos solubles en agua (-OH, -COOH, - CONH2, -CONH, SO3H). Tienen un alto contenido acuoso similar al de los tejidos nativos (Elisseeff ef al., 2005).

2. Insoluble en agua: debido a la existencia de una red polimérica tridimensional cohesiva en su estructura.

3. Tienen una consistencia gelatinosa que está determinada por el monómero de partida hidrófilo y la baja densidad de reticulación del polímero.

Tienen la capacidad para hincharse en presencia de agua o disoluciones acuosas, aumentando considerablemente su volumen hasta que alcanzan el equilibrio fisicoquímico, pero sin perder su forma. Esta capacidad para hincharse proporciona un microentorno acuoso comparable al que están sometidas las células en tejidos blandos. La presencia de agua y de una estructura porosa también permite el flujo de solutos de bajo peso molecular y de nutrientes que son cruciales y esenciales para la viabilidad celular, así como el transporte de desechos celulares fuera del hidrogel (Torres et al., 00).

Los glicosaminoglicanos (GAG), también denominados mucopolisacáridos, son heteropolisacáridos que se encuentran en organismos unidos a un núcleo de proteína formando macromoléculas denominadas proteoglicanos. Éstos pueden encontrarse en las superficies de células o en la matriz extracelular y llevar a cabo importantes funciones para interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Están en formas sulfatadas y no sulfatadas con un resto molecular característico común que implica una secuencia repetida de disacáridos formados por dos azúcares diferentes: uno de ellos es habitualmente un hexuronato mientras que el otro es una hexosamina. La variación configuracional en los enlaces de los disacáridos y la posición de sulfatación conduce a un aumento de la diversidad en las propiedades físicas y químicas de estas cadenas. El alto contenido en sulfato y la presencia de

ácido uránico confiere a los GAG una gran carga negativa, de modo que la gran cantidad de GAG en GW hace que este tejido sea extremadamente hidrófilo.

Existen varios tipos de GAG, que están directamente implicados en funciones celulares básicas, no sólo debido a su estructura, sino también porque son sitios de anclaje para varias moléculas de señalización celulares.

El ácido hialurónico es el GAG más abundante en GW. Es el único miembro no sulfatado de la familia de los GAG que funciona in vivo como un hidrato de carbono libre, consistiendo su estructura en repeticiones de un disacárido: ácido D-glucurónico y (1 -(3-3) N-acetil-D-glucosamina (Goa et al., 1994; Laurent et al., 1992). Se sintetiza por varios tipos celulares y se secreta en el espacio extracelular en el que interacciona con otros componentes de la matriz extracelular para crear la estructura de soporte y protección que rodea las células (Collins et al., 2008). Es un polímero lineal polianiónico grande que presenta moléculas individuales que pueden tener un peso molecular de 100.000 a 5xl06 Da (Toole et al., 2004; Bertolami et al., 1992). Tiene una estructura helicoidal que ocupa un gran volumen, lo que conduce a disoluciones de alta viscosidad. Las moléculas individuales de ácido hialurónico se asocian entre sí, formando redes o retículas. En tejidos en desarrollo, se considera que el ácido hialurónico es la principal macromolécula estructural implicada en la proliferación y migración celulares.

Se ha implicado el ácido hialurónico en varios procesos, tales como vascularización, morfogénesis, y en la integridad general y reparación de la matriz extracelular. Se sabe que una gran cantidad de ácido hialurónico contenido en el líquido amniótico favorece la reparación de heridas fetales (Longaker et al., 1989). Además se han observado variaciones en sus propiedades moleculares entre piel sana y cicatrices, siendo el ácido hialurónico de la cicatrización típica diferente al de la cicatrización hipertrófica (Ueno et al., 1992).

El sulfato de condroitina es un polímero lineal formado por un dímero de ácido D-glucurónico y repetición de N- acetilgalactosamina. Su utilidad se ha sometido a prueba en terapias dirigidas contra enfermedades articulares por medio de la inhibición de la actividad de las enzimas responsables de la degradación de la matriz de los componentes del cartílago. Puede actuar como antiinflamatorio por medio de la inhibición del complemento y es útil en el tratamiento de trastornos tromboembólicos, en cirugía y clínicas oftalmológicas.

El sulfato de dermatano, también conocido como sulfato de condroitina B, es un potente anticoagulante debido a su efecto inhibidor selectivo sobre la trombina a través del cofactor II de heparina, siendo muy eficaz in vivo debido a su menor riesgo hemorrágico (Trowbridge et al., 2002).

Los glicosaminoglicanos en general y la heparina en particular, tienen la capacidad para modular la actividad de la cascada plasmática, potenciando la inhibición de la ruta de coagulación intrínseca e inhibiendo la ruta de activación del complemento clásica en diferentes puntos (Rabenstein, 2001). Otras funciones conocidas de la heparina son la inhibición de la angiogénesis, el crecimiento humoral y su actividad antiviral.

El sulfato de heparano tiene una estructura que está relacionada estrechamente con la heparina. Está distribuido ampliamente en tejidos animales y entre sus funciones, la adhesión celular y la regulación de la proliferación celular, son primordiales. Tiene un efecto protector frente a la degradación de proteínas, regulando su transporte a través de la membrana basal y también interviniendo en la internalización de las mismas (Rabenstein, 2001).

Existen varios documentos... [Seguir leyendo]

1. Un biomaterial en forma de un hidrogel inyectable,

que comprende un extracto de gelatina de Wharton del cordón umbilical de animales (no humanos), caracterizado por que:

- dicho extracto consiste en la mezcla de gllcosaminoglicanos (GAG) presentes en el cordón umbilical, que consiste en ácido hialurónlco, sulfato de queratano, 6-sulfato de condroltlna, sulfato de heparano, 4-sulfato de condroltlna, sulfato de dermatano y heparina, y

- dicho extracto carece de membrana de cordón umbilical, de vasos sanguíneos y de células o de restos de células, tal como se presentan originalmente en la gelatina de Wharton.

2. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende ácido hialurónlco al 40-80% de la mezcla total de GAG.

3. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende sulfato de queratano al 2-25% de la mezcla total de GAG.

4. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende 6-sulfato de condroitina al 3-10% de la mezcla total de GAG.

5- El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende sulfato de heparano al 1-9% de la mezcla total de GAG.

6. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende 4-sulfato de condroitina al 0,5-7% de la mezcla total de GAG.

7. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende sulfato de dermatano al 0,1-7% de la mezcla total de GAG.

8. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende heparina al 0,05-3% de la mezcla total de GAG.

9. El biomaterial según la reivindicación 1, caracterizado por que contiene: ácido hialurónlco (70%), sulfato de queratano (10%), 6-sulfato de condroitina (7%), sulfato de heparano (5%), 4-sulfato de condroitina (4%), sulfato de dermatano (3%) y heparina (1%).

10. El biomaterial según las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el hidrogel inyectable tiene una viscosidad de 10 cS-150.000 cS.

11. El biomaterial según la reivindicación 10, caracterizado por que tiene una viscosidad de entre 10 y 15.000 cS.

12. El biomaterial según la reivindicación 11, caracterizado porque tiene una viscosidad de entre 10 y 2.000 cS.

13. El biomaterial según las reivindicaciones 1-10, caracterizado por que tiene una estructura tridimensional.

14. El biomaterial según la reivindicación 13, caracterizado por que tiene una estructura sustancialmente porosa con un diámetro de poro de 0,5-1000 pm.

15. El biomaterial según la reivindicación 14, caracterizado porque el diámetro de poro es de 0,5-500 pm.

16. El biomaterial según las reivindicaciones 1-15, caracterizado por que comprende adicionalmente células distintas de las originalmente presentes en la gelatina de Warthon.

17. El biomaterial según la reivindicación 16, caracterizado por que dichas células se seleccionan del grupo que consiste en células madre mesenquimatosas no diferenciadas o células madre mesenquimatosas diferenciadas en otra estirpe celular y/o células madre hematopoyéticas no diferenciadas o células madre hematopoyéticas diferenciadas en otra estirpe celular y/o condrocitos y/o condroblastos y/o osteoblastos y/o osteocitos y/o queratinocitos y/o fibroblastos y/o miocitos y/o adipocitos y/o neuronas y/u otras células del sistema nervioso y/o células del sistema de glóbulos blancos y/o células corneales y/o células endoteliales y/o células epiteliales.

18. Un biomaterial según cualquier reivindicación anterior, combinándose el biomaterial con un material de refuerzo para formar un material compuesto.

19. Un procedimiento para obtener el biomaterial según las reivindicaciones 1-18, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) obtener un cordón umbilical de origen animal (no humano);

b) tratar el cordón umbilical con una disolución salina y antibióticos;

c) eliminar toda la sangre de la superficie del cordón;

d) fragmentar el cordón en secciones de 1-2 cm;

e) limpiar toda la sangre retenida en el interior;

f) eliminar la membrana del cordón umbilical y los vasos sanguíneos;

g) separar la sustancia gelatinosa que comprende la gelatina de Wharton;

h) digerir enzimáticamente la sustancia gelatinosa obtenida;

i) precipitar y aislar los GAG; y resuspender el precipitado sólido en H2O Milli-Q para obtener un extracto acuoso que consiste en una mezcla de GAG que consiste en ácido hialurónico, sulfato de queratano, 6-sulfato de condroitina, sulfato de heparano, 4-sulfato de condroitina, sulfato de dermatano y heparina, y careciendo dicho extracto de membrana de cordón umbilical, de vasos sanguíneos y de células o de restos de células, tal como se presentan originalmente en la gelatina de Wharton;

j) Opcionalmente, reticular los GAG obtenidos en la etapa i).

20. El procedimiento para obtener el biomaterial según la reivindicación 19, caracterizado porque la reticulación es reticulación covalente y se lleva a cabo mediante cambios en la temperatura, reacciones químicas o fotopolimerización.

21. El procedimiento para obtener el biomaterial obtenido según la reivindicación 20, caracterizado por que la reticulación es iónica y se lleva a cabo mediante modificaciones de grupos laterales en componentes de GAG individuales en la GW.

22. El biomaterial según las reivindicaciones 1-18, para su uso en la remodelación, el relleno o la reconstrucción de

tejidos blandos, el tratamiento de arrugas, pliegues y cicatrices, quemaduras, úlceras, aumento de tejidos blandos, lipoatrofia facial, enfermedades de los discos intervertebrales, reparación de cartílago, lesiones

musculoesqueléticas, osteoartritis y periartritis; tratamiento de tumores, enfermedades vaginales, lesiones cerebrales, reparación de médula, trastornos degenerativos, enfermedades cardiovasculares y procesos de lubricación, como analgésico y antiinflamatorio; tratamiento de quemaduras, úlceras y defectos dermoepidérmicos, tratamiento de enfermedades oftalmológicas, tales como lesiones corneales, lesiones retinianas o cataratas; reparación de cartílago, tratamiento del sistema osteoarticular, como en el caso de defectos osteocondrales, osteoartritis o defectos óseos, y como un adyuvante en la resolución de enfermedades vaginales, tratamiento de gingivitis y periodontitis; y para su uso en el desarrollo de sistemas de cultivo celular.