Sistema de transporte celular.

Sistema de transporte celular caracterizado porque comprende un soporte celular,

células y una mezcla homogénea de agarosa y agarasa, que garantiza la integridad y viabilidad celular durante el proceso de transporte.

Sistema de transporte celular .

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un sistema para el transporte celular. Dicho sistema permite el transporte de células, garantizando su integridad y viabilidad durante todo el proceso de transporte. Consiste en un sistema adecuado para una gran variedad de formatos que permite un amplio rango de aplicaciones técnicas del sistema. El sistema de la invención permite proporcionar células listas para su uso, sin tener que manipularse las células antes de usarse por expertos técnicos en biología celular. En particular, la invención hace referencia a una mezcla de agarosa más agarasa que cubre o envuelve, dependiendo del formato del sistema de transporte seleccionado, el cultivo celular, protegiéndolo durante el proceso de transporte, así como a la metodología de recuperación celular de las células transportadas en el sistema.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existe un interés en el estado de la técnica en obtener sistemas de transporte que, manteniendo la integridad y viabilidad de las células, no requieran del manejo de metodologías complicadas, tanto durante su transporte como durante el proceso para la recuperación de las células, en su destino final.

Actualmente el transporte celular se lleva a cabo de dos formas diferentes, transportando las células en estado crioconservado o cultivado.

Las técnicas para el transporte de células en cultivo permiten que las células estén adheridas o en suspensión, en frascos con medio de cultivo líquido. En esta metodología, es necesario ser extremadamente cuidadoso con las condiciones de transporte, ya que pequeños movimientos sostenidos en el tiempo durante su transporte influyen de forma definitiva en la integridad y capacidad de adhesión celular y por lo tanto en la viabilidad de las células en su destino. Esto significa que la gran mayoría de los cultivos así transportados no lleguen al lugar de destino en condiciones de viabilidad aptas para utilizarse en los diversos proyectos de investigación, entendiendo por viabilidad celular que no se produzcan alteraciones morfológicas y/o funcionales en las células.

Es por ello que un sistema de transporte de cultivos celulares efectivo debe asegurar que durante todo el proceso de transporte y el proceso para la recuperación de las células para su uso, la integridad de las mismas se mantenga de forma óptima (referencias 15-19) , es decir, que la viabilidad de las mismas no se vea afectada durante todo el proceso.

El transporte en estado crioconservado implica el transporte de viales de células en estado de criocongelación, lo que significa que, para que las células se usen de nuevo, el lugar de destino debe contar con instalaciones y personal que están especializados en el cultivo celular, una laboriosa manipulación que incluye la amplificación y el mantenimiento celular, y la disposición de las células en los formatos requeridos para el desarrollo de las técnicas de testado.

Así, un aspecto a tener en cuenta en el transporte celular es la temperatura a la que se transportan las células, ya que esta temperatura afecta directamente al mantenimiento de la integridad celular, debido al hecho de que la mayoría de las líneas y tipos celulares son sensibles frente a los cambios de temperatura.

La crioconservación implica unas temperaturas de transporte muy bajas y constantes, difíciles de mantener durante todo el tiempo de transporte. Esto significa que el transporte debe tener lugar en unas condiciones muy específicas, es decir, los viales deben mantenerse a temperaturas inferiores a –80ºC durante todo el proceso de transporte, ya que si no la viabilidad celular se vería gravemente afectada.

La temperatura de crecimiento óptima de los cultivos de células animales es de 36-38ºC. Superado este intervalo de temperatura (condiciones de hipertermia) la viabilidad celular se ve afectada, dañando de manera irreversible la integridad de las células del cultivo, y provocando la muerte celular.

Las temperaturas por debajo del intervalo de temperatura óptima (condiciones de hipotermia) se toleran mejor por los cultivos celulares que las temperaturas altas. Así, en el caso de la aplicación de una temperatura inferior a la óptima recomendada, se produce una disminución en el metabolismo celular, es decir, las reacciones celulares (proliferación,

metabolismos, crecimiento, …) se ralentizan pero la célula mantiene su integridad, y cuando se restablecen las condiciones térmicas óptimas para el crecimiento, las células recuperan su actividad celular.

En el estado de la técnica, la hipotermia es una metodología ampliamente usada para la ralentización del crecimiento de microorganismos y células tumorales. El sistema descrito en la presente invención se vale de dicha característica de manera que las células presentan su metabolismo ralentizado durante el transporte, ayudando al mantenimiento de su integridad.

El estado de la técnica comprende varios sistemas para el transporte de células en cultivo. En determinados documentos, los cultivos celulares se cubren con medios de cultivo al 1-20% de gelatina líquida que, tras su solidificación, pueden transportarse sin que las células experimenten daños. Otros documentos, sin embargo, describen dispositivos específicos para el cultivo, almacenamiento y transporte de cultivos celulares.

La solicitud de patente P200301526 describe un método para el almacenamiento y el transporte de cultivos celulares bidimensionales en el que se inmovilizan las células sobre un soporte asimétrico, de tipo Transwell, que se cubre con una disolución de gelatina a una concentración del 1 al 5% que solidifica por enfriamiento, facilitando así que el sistema pueda transportarse manteniendo la integridad celular del cultivo. Ya en el laboratorio de destino se incuba la placa a 37ºC durante 4 horas para que la gelatina se licue y poder retirarla del cultivo celular, estando listas las células para realizar los ensayos de migración oportunos. Este sistema, sin embargo, no permite el uso del cultivo celular para otras aplicaciones que no sean ensayos en los soportes asimétricos de tipo Transwell.

En cambio, la invención propuesta en el presente documento es adecuada para cualquier formato de cultivo celular requerido según su aplicación específica o bien en el propio sistema de transporte o bien una vez que se extrae del mismo y permite que la recuperación celular se produzca en un tiempo no superior a 3 horas, tiempo inferior al descrito por la solicitud de patente española P200301526 (4 horas) .

La patente europea EP0702081 describe un método para el almacenamiento y transporte de tejidos tridimensionales. La invención descrita en este documento consiste en situar un cultivo tridimensional de piel fijado sobre dos tipos de esponja cubiertos por una disolución de gelatina del 1-20%, preferiblemente del 5-10%, de manera que cuando la disolución gelifica por enfriamiento se facilita su transporte y almacenamiento. Al igual que en la solicitud de patente española mencionada anteriormente, este documento describe el método usado para retirar la gelatina del cultivo tridimensional que consiste en aumentar la temperatura hasta un máximo de 37ºC para licuarla, preservando la integridad celular del sistema. El documento, especifica que el uso de agarosa no sería adecuado para este sistema, ya que el punto de fusión de la agarosa se encuentra en torno a los 60ºC, es decir, muy por encima de la temperatura que permite la viabilidad celular. El sistema descrito por este documento no permite la recuperación del cultivo celular para su empleo fuera del mismo.

La solicitud de patente internacional W02007/080600 describe un dispositivo desechable para el cultivo y/o almacenamiento y transporte de células adherentes viables. En dicho dispositivo las células se siembran sobre membranas, geles o sustratos microporosos sujetos al dispositivo sobre el que después se añadirá un medio que proveerá a las células con los nutrientes necesarios para mantener su crecimiento. El dispositivo se cierra de forma segura evitando pérdidas de líquido y la entrada de aire al compartimento en el que se cultivan las células. Una vez que el dispositivo llega a su destino, se extrae y se limpia la membrana, el gel o sustrato sobre el que las células están sembradas y puede procederse al trasplante del mismo. Sin embargo, el documento no indica en ningún caso que las células se separen de la membrana sobre las que se cultivan, de manera que tales células no pueden usarse de forma independiente. El dispositivo descrito por este documento además no permite el transporte de cultivos celulares que no sean adherentes.

1. Sistema de transporte celular caracterizado porque comprende un soporte celular, células y una mezcla homogénea de agarosa y agarasa, que garantiza la integridad y viabilidad celular durante el proceso de transporte.

2. Sistema de transporte celular según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células pertenecen a cualquier tipo celular

3. Sistema de transporte celular según la reivindicación 1-2, caracterizado porque dichas células se seleccionan del grupo de células adherentes, células semi-adherentes y células no adherentes.

4. Sistema de transporte según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células son de origen animal.

5. Sistema de transporte según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células se seleccionan del grupo de células humanas, murinas, caninas, bovinas y/u ovinas.

6. Sistema de transporte según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células se seleccionan del grupo de células nerviosas, células del sistema nervioso central, células del sistema nervioso periférico, células del sistema dermo-epitelial, células del sistema osteoarticular, células progenitoras pluripotenciales embrionarias, células progenitoras pluripotenciales adultas, células progenitoras multipotenciales embrionarias, células progenitoras multipotenciales adultas, células del sistema hematopoyético, células del sistema inmunitario y/o células del sistema muscular.

7. Sistema de transporte según las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque las células se seleccionan del grupo de neuronas, células de la glía, células no gliales, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, condroblastos, condrocitos, fibroblastos, queratinocitos, melanocitos, células glandulares, células corneales, células retinianas, células madre mesenquimatosas, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células epiteliales, plaquetas, timocitos, linfocitos, monocitos, macrófagos, miocitos, hepatocitos, células renales, células uretrales, cardiomiocitos, mioblastos y/o células germinales.

8. Sistema de transporte según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque las células son células tumorales o líneas celulares establecidas a partir de cualquiera de los tipos celulares mencionados anteriormente.

9. Sistema de transporte según las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque las células están genéticamente modificadas.

10. Sistema de transporte según las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque las células son neuronas.

11. Sistema de transporte según las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque las células son neuronas genéticamente modificadas.

12. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células se cultivan en forma de monocapa sobre la cual se añade la mezcla de agarosa y agarasa.

13. Sistema de transporte celular que comprende células según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células se cultivan en suspensión incluidas en la mezcla de agarosa y agarasa.

14. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el soporte celular presenta cualquier formato de cultivo celular.

15. Sistema de transporte celular según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho formato se selecciona del grupo que comprende placas, frascos, tubos, cámaras de cultivo, botellas o sistemas asimétricos de tipo Transwell (cultivo tridimensional) .

16. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones 12-15, caracterizado porque la superficie del soporte celular opcionalmente incluye componentes de la matriz extracelular que aumentan la capacidad de adherencia de las células al soporte, permitiendo el cultivo celular monocapa.

17. Sistema de transporte celular según la reivindicación 16, caracterizado porque dicho componente de la matriz extracelular que aumenta la capacidad de adherencia de las células al soporte es poli-L-lisina a una concentración de 10 – 75

18. Sistema de transporte celular según la reivindicación 17, caracterizado porque la concentración de poli-L-lisina en el soporte celular es de 50 – 75

19. Sistema de transporte celular según la reivindicación 18, caracterizado porque la concentración de poli-L-lisina en el soporte celular es de 60 g/ml.

20. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de agarasa en el medio de transporte es de entre 60 y 90 unidades por mililitro de agarosa al 1%.

21. Sistema de transporte celular según la reivindicación 20, caracterizado porque la concentración de agarasa en el medio de transporte es preferentemente de 80 unidades por mililitro de agarosa al 1%.

22. Sistema de transporte según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la agarosa usada es agarosa de bajo punto de fusión

23. Sistema de transporte según la reivindicación 22, caracterizado porque el punto de fusión de la agarosa es próximo a 42ºC.

24. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración final de agarosa en el medio de transporte es del 0, 2 al 0, 6%.

25. Sistema de transporte celular según la reivindicación 24, caracterizado porque la concentración final de agarosa en el medio de transporte es del 0, 5%.

26. Sistema de transporte celular según la reivindicación 25, caracterizado porque comprende una mezcla de agarosa de bajo punto de fusión a una concentración del 0, 5% y agarasa a una concentración de 80 unidades por mililitro de agarosa al 1%.

27. Sistema de transporte que comprende una mezcla de agarosa y agarasa según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla de agarosa y agarasa permanece en estado semi-sólido a temperaturas no superiores a 25ºC.

28. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla de agarosa y agarasa permanece en estado líquido cuando se digiere la agarosa por la agarasa.

29. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla de agarosa y agarasa se retira del soporte celular dejando el cultivo celular listo para usarse en diferentes aplicaciones.

30. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque permite la extracción de las células del sistema de transporte mediante técnicas de cultivo celular básicas.

31. Sistema de transporte celular según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque garantiza la viabilidad e integridad celular de al menos el 85% de las células cultivadas.

32. Método para el transporte de células que implica la preparación del sistema de transporte según las reivindicaciones 1-26, el transporte y la recuperación de las células.

33. Método para el transporte de células según la reivindicación 32, caracterizado porque la etapa de preparación del sistema de transporte celular comprende las siguientes etapas:

a. sembrar el cultivo celular,

b. preparar la mezcla de agarosa y agarasa según las reivindicacione.

2. 26,

c. añadir la mezcla de la etapa b al cultivo celular,

d. solidificar la mezcla de agarosa y agarasa,

e. sellar el sistema de transporte.

34. Método para el transporte de células según la reivindicación 33, caracterizado porque la etapa b implica las siguientes etapas:

i.mezclar la disolución de agarosa en el medio de cultivo específico para el tipo del cultivo celular que va a transportarse a la concentración establecida según las reivindicacione.

2. 25,

ii.añadir la agarasa a la concentración establecida según las reivindicacione.

2. 21, a la disolución de agarosa de la etapa i,

iii.homogenizar la mezcla y atemperarla a 37ºC.

35. Método para el transporte de células según las reivindicacione.

3. 34, caracterizado porque la etapa c implica recubrir las células cultivadas en monocapa con la mezcla de la etapa b preparada según la reivindicación 34.

36. Método para el transporte de células según las reivindicacione.

3. 34, caracterizado porque la etapa c implica la mezcla homogénea de las células en suspensión con la mezcla de la etapa b preparada según la reivindicación 34.

37. Método para el transporte de células según las reivindicacione.

3. 34, caracterizado porque la etapa d se lleva a cabo a temperatura inferior a 37ºC en un periodo de 15-30 minutos.

38. Método para el transporte de células según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de transporte se lleva a cabo a temperaturas no superiores a 25ºC, siendo el tiempo de transporte no superior a 60 horas.

39. Método para el transporte de células según la reivindicación 38, caracterizado porque el transporte se lleva a cabo en un intervalo de temperatura de entre 18 y 23ºC, siendo el tiempo de transporte no superior a 48 horas.

40. Método para el transporte de células según la reivindicación 39, caracterizado porque el transporte se lleva a cabo a una temperatura de 22ºC.

41. Método para el transporte de células según las reivindicacione.

3. 40, caracterizado porque el transporte se realiza en el interior de dispositivos de acondicionamiento portátiles que pueden mantener los intervalos de temperatura durante el tiempo adecuado independientemente de la temperatura ambiente.

42. Método para el transporte de células según las reivindicacione.

3. 40, caracterizado porque la viabilidad de las células transportadas es de al menos el 85%.

43. Método para el transporte de células según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la recuperación de las células comprende las siguientes etapas:

f. digerir la mezcla de agarosa y agarasa,

g. retirar el medio de transporte y sustituirlo por medio de cultivo,

h. restablecer el cultivo celular.

44. Método para el transporte de células según la reivindicación 43, caracterizado porque la etapa f comprende las siguientes etapas:

incubar el sistema de transporte a 37ºC durante un periodo de tiempo de entre 1, 5-2 horas,

añadir medio de cultivo atemperado,

incubar el sistema durante una hora adicional a 37ºC.

45. Método para el transporte de células según la reivindicación 43, caracterizado porque cuando las células están en suspensión, la etapa f comprende una etapa 4 adicional que consiste en centrifugar el sistema .

80. 1000 g.

46. Método de transporte de células según la reivindicación 43, caracterizado porque el restablecimiento del cultivo celular implica la incubación de las células a 37ºC y el 5% de CO2.

47. Método para el transporte de células según la reivindicación 43, caracterizado porque las células se extraen del soporte que las transportaba.

48. Método para el transporte de células según la reivindicación 43, caracterizado porque las células permanecen en el propio soporte que las transportaba.

49. Uso del sistema de transporte según las reivindicaciones 1-31, para llevar a cabo ensayos de biología celular y/o molecular.

50. Uso del sistema de transporte según la reivindicación 49, para llevar a cabo ensayos seleccionados del grupo que comprende las pruebas de fármacos, biomateriales y nanopartículas, ensayos funcionales, estudios morfológicos, estudios para caracterizar la expresión génica, estudios para caracterizar la expresión de proteínas.