Nueva línea de células humanas permanente.

Un método para la producción de una línea de células amniocíticas humanas permanente que comprende:

a) transfectar células amniocíticas humanas primarias con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los productos génicos adenovirales E1A y E1B y

b) subsiguientemente transfectar la línea de células amniocíticas humanas permanente obtenida en la etapa a) con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1).

Nueva línea de células humanas permanente

La presente invención se refiere a un método para la producción de una línea de células humanas permanente, que comprende transfectar células amniocíticas humanas primarias con moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los productos génicos adenovirales E1A y E1B y transfectar subsiguientemente con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1).

Además de bacterias, levaduras, y células vegetales, se usan células animales en particular para la producción de polipéptidos y proteínas recombinantes. En la actualidad, aproximadamente del 60 al 70% de todas las proteínas terapéuticas son producidas en células de mamíferos (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393 - 1398, 2004). La producción de polipéptidos o proteínas recombinantes en cultivo celular, es decir in vitro, con fines terapéuticos, de diagnóstico o técnicos, puede efectuarse generalmente de dos diferentes maneras. En líneas de células establecidas estables, duraderas o permanentes, el ácido nucleico que codifica el polipéptido o la proteína deseada se integra en el ADN cromosómico de la célula con al menos una copia y se pasa junto con el juego de cromosomas celulares a las células hijas en la división de la célula (la llamada expresión estable en líneas de células de producción). Para la producción de estas líneas de células de producción estables es necesario que al menos uno de los ácidos nucleicos introducido en la célula mediante transfección lleve una función génica que proporcione una ventaja en términos de selección en cultivo de células durante el crecimiento. El ácido nucleico que tiene tal función génica no está necesariamente en la misma molécula que la casete de expresión para el polipéptido o proteína deseados. Dicha función génica es o bien un gen de resistencia a antibiótico o un gen de resistencia frente a agentes quimioterapéuticos en el medio (por ejemplo, usado frecuentemente para células de mamífero; Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393 - 1398, 2004), un gen que tiene un producto génlco que complementa una ruta metabólica deficiente (por ejemplo, usado en células de levadura), o una función génica de transformación (que se muestra para células amniocíticas humanas; Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). De esta forma se asegura que tales células que tienen una integración estable del ácido nucleico transfectado en el ADN cromosómico de la célula y que producen dicho producto génico sobrecrecen otras células sin tal integración y pueden ser seleccionadas. En la preparación de células de producción por transfección en la llamada línea de células hospedadoras por una parte el ácido nucleico que codifica el polipéptido recombinante (el denominado transgén) se transfiere junto con los elementos de regulación transcrlpclonal necesarios, y por otra parte se transfiere una segunda casete de expresión que tiene un gen que codifica un marcador de selección cuyo producto génico proporciona una cierta ventaja en términos de selección. Unos pocos días después de la transferencia de genes durante los cuales se cultivan las células, por ejemplo en un medio de cultivo sin reactivo de selección, se añade al medio un reactivo de selección adecuado. En presencia de dicho reactivo de selección solamente sobreviven y crecen aquellas células que tienen integrados los ácidos nucleicos usados para la transfección y expresión del marcador de selección. Son marcadores de selección usados comúnmente el gen de resistencia a la neomicina, el gen de resistencia a la higromicina y la dihidrofolato reductasa (DHFR) (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393 - 1398, 2004; Wurm y Jordán, 309 - 333 en: Makrides (Hrsg), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003). En consecuencia, la selección se lleva a cabo en medio de cultivo con reactivos de selección tales como los antibióticos neomicina o higromicina y el glucocorticoide sintético metotrexato, respectivamente. Generalmente, las células que tienen el marcador de selección y el transgén, que sobreviven al proceso de selección y proliferación (los llamados transformantes) son subsiguientemente singularizados (clonados) para asegurar que todas las células en el cultivo son genéticamente idénticas y separar las líneas de células de producción deseadas que tienen la mejor tasa de producción, de las líneas de células con menos capacidad productora.

En cambio, para la llamada expresión transitoria el ácido nucleico introducido en la célula por transfección y que codifica el polipéptido o proteína deseados no está integrado en el ADN cromosómico de la célula y no se selecciona para este resultado, respectivamente. Así pues, el ácido nucleico introducido se diluye generalmente y se pierde en el curso de la división celular durante el crecimiento en cultivo. Esto presupone la naturaleza temporal transitoria de este método de expresión. La selección de las líneas de células de producción estables con una buena eficiencia de expresión lleva varios meses y produce unos costes considerables. En cambio, la cantidad de miligramos de polipéptido o proteína deseados se puede producir en unos pocos días por expresión transitoria. Velocidad y costes son factores esenciales para el desarrollo industrial de los productos biofarmacéuticos y de diagnóstico. La expresión transitoria de proteínas en pequeñas cantidades o de diferentes variantes de proteínas se lleva a cabo por tanto junto a la investigación fundamental para el desarrollo temprano explorativo y preclínico, por ejemplo para la identificación de dianas, el desarrollo del ensayo, la caracterización bioquímica de los productos génicos, para la toxicología y para la farmacocinética, así como para investigaciones farmacodinámicas (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677 - 684, 2007; Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 225 - 237, 2006). En cambio, la producción industrial de proteínas en escala de gramos hasta kilogramos para la realización de estudios clínicos más grandes y el suministro al mercado, se realiza mediante líneas de células de producción estables.

Por ejemplo, en el documento EP 1948789 se describe un método para la producción de una línea de células amniocíticas humanas permanente por transfección de un factor de transformación de la célula sin usar un marcador de selección.

Hasta ahora se pudieron producir proteínas secretadas, unidas a la membrana e intracelulares por expresión génica transitoria. Actualmente, las células de mamíferos son los sistemas de expresión más comúnmente usados para muchas proteínas complejas, en particular si dichas proteínas deben usarse con fines terapéuticos, ya que los sistemas de células procariotas y eucariotas simples (por ejemplo, las levaduras) están en clara desventaja en lo que se refiere a modificaciones postraduccionales. Hasta ahora se han utilizado básicamente cuatro líneas de células de mamíferos para la expresión transitoria de proteínas: células COS-1 y COS-7, respectivamente, que derivan de la línea celular CV-1 derivada de células de riñón del mono verde africano; células BHK derivadas de células de riñón de la cría del hámster; células CHO derivadas del ovario del hámster chino; y células HEK293, una línea de células de riñón embrionario humano que tiene características neuronales (Pham et al, Molecular Biotechnology 34, 225 - 237, 2006; Wurm y Bernard, Current Opinión ¡n Blotechnology 10, 156 - 159, 1999). La expresión transitoria en líneas de células de mamífero se basa generalmente en la transfección de un vector de plásmido que incorpora la casete de expresión con la secuencia que codifica el producto génico deseado. También se pueden utilizar vectores de expresión virales, tales como virus Semllkl Forest o adenovirus pero son poco comunes ya que son eficientes pero precisan tiempo y están relacionados con altos requisitos de seguridad. Se ha desarrollado una diversidad de métodos físicos y químicos para la transferencia de ADN en células de mamífero cultivadas. Los métodos físicos para la transferencia de genes comprenden electroporación, nucleofección y microinyección. Para el uso de métodos de transfección químicas se utilizan sustancias inorgánicas (por ejemplo co- precipitación de fosfato cálcico/ADN), polímeros catiónicos (p. ej. polletllenlmlna, el método de DEAE-dextrano) o lípidos catiónicos (la llamada lipofección). El fosfato de calcio y la polletllenimlna son los reactivos más comúnmente usados para la transfección para la transferencia de ácidos nucleicos... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de una línea de células amniocíticas humanas permanente que comprende:

a) transfectar células amniocíticas humanas primarias con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los productos génicos adenovirales E1Ay E1B y

5 b) subsiguientemente transfectar la línea de células amniocíticas humanas permanente obtenida en la etapa a) con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1).

2. El método según la reivindicación 1a, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las funciones génicas adenovirales E1A y E1B se deriva de un adenovirus humano, en particular el adenovirus humano de

10 serotipo 5.

3. El método según la reivindicación 2a, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica los productos génicos adenovirales E1A y E1B comprende los nucleótidos 1 a 4344, 505 a 3522, o los nucleótidos 505 a 4079 del adenovirus humano de serotipo 5.

4. El método según la reivindicación 1a, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T 15 grande de SV40 comprende además la secuencia de ácidos nucleicos para un promotor seleccionado entre el grupo

de promotor de CMV, promotor de CAG y promotor de RSV, la secuencia de ácidos nucleicos para SD/SA de SV40 (intrón) y la secuencia de ácidos nucleicos para poliA de SV40, y la secuencia de ácidos nucleicos para el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBV) (EBNA-1) comprende además la secuencia de ácidos nucleicos para un promotor seleccionado entre el grupo del promotor de CMV, promotor de CAG y promotor de RSV, la secuencia de 20 ácidos nucleicos para SD/SA de SV40 (intrón) y la secuencia de ácidos nucleicos para poliA de SV40.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en vez de la etapa a) se usan las líneas de células amniocíticas humanas ya inmortalizadas con una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los productos génicos adenovirales E1A y E1B.