N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora, métodos de tratamiento usando dicha enzima y métodos para producir y purificar dicha enzima.

Composición que comprende N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora,

en la que dicha Nacetilgalactosamina- 4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de fase inversa HPLC (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadamente 47-48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie.

A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora, métodos de tratamiento usando dicha enzima y métodos para producir y purificar dicha enzima

La presente es una continuación en parte del documento de los EE. UU. con N.° de serie 10/290.908, presentado el 7 de noviembre de 2002.

Campo de la invención

La presente invención se encuentra en el campo de la medicina clínica, la bioquímica y la biología molecular. La presente invención presenta agentes terapéuticos y métodos para tratar la mucopolisacaridosis VI así como procedimientos de producción y purificación para producir tales agentes terapéuticos.

Antecedentes de la invención

La MPS VI (síndrome de Maroteaux-Lamy) es una enfermedad de almacenamiento lisosómico en la que los pacientes afectados carecen de la enzima A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB). La enzima metaboliza el resto sulfato del glicosaminogllcano (GAG) sulfato de dermatano (Neufeld, et al., The mucopolysaccharidoses The Metabolic Basis of Inherited Disease, eds. Scriver et al., New York:McGraw-Hill, 1989, págs. 1565-1587). En ausencia de la enzima, se bloquea la degradación gradual del sulfato de dermatano y el sustrato se acumula intracelularmente en el llsosoma en una amplia variedad de tejidos. La acumulación produce un trastorno progresivo con implicación de múltiples órganos y tejidos en el que el bebé parece normal en el nacimiento, pero habitualmente muere antes de la pubertad. El diagnóstico de MPS VI se realiza habitualmente a los 6-24 meses de edad cuando los niños muestran desaceleración progresiva del crecimiento, hígado y bazo agrandados, deformidades esqueléticas, rasgos faciales indeterminados, obstrucción de las vías aéreas superiores y deformidades articulares. Pueden desarrollarse opacificación progresiva de la córnea, hidrocefalia comunicante o enfermedad cardiaca en niños con MPS VI. Habitualmente la muerte resulta de infección respiratoria o enfermedad cardiaca. A diferencia de la MPS I, la MPS VI normalmente no se asocia con afectación progresiva del estado mental, aunque las limitaciones físicas pueden afectar al aprendizaje y el desarrollo. Aunque la mayoría de los pacientes con MPS VI tienen la forma grave de la enfermedad que habitualmente es letal hacia la adolescencia, se han descrito pacientes afectados con una forma menos grave de la enfermedad que pueden sobrevivir durante décadas.

Varias publicaciones proporcionan estimaciones de la incidencia de MPS VI. Un estudio de 1990 de British Columbia de todos los nacimientos entre 1952 y 1986 publicado por Lowry et al (Lowry, et al., Human Genet 85:389-390 (1990)) estima una incidencia de sólo 1:1.300.000. Un estudio australiano (Meikle et al., JAMA 281(3):249-54) de los nacimientos entre 1980-1996 encontró 18 pacientes para una incidencia de 1:248.000. Un estudio en Irlanda del Norte (Nelson, et al., Hum. Genet. 101:355-358 (1997)) estimó una incidencia de 1:840.000. Finalmente, un estudio de los Países Bajos de 1970-1996 calculó una prevalencia de 0,24 por 100.000 (Poorthuis, et al., Hum. Genet. 105:151-156 (1999)). Basándose en estos estudios, se estima que hay entre 50 y 300 pacientes en los EE.UU. a los que se ha diagnosticado con todas las formas de este síndrome.

No hay tratamiento satisfactorio para la MPS VI aunque algunos pacientes se han beneficiado de trasplante de médula ósea (BMT) (Krivit, et al., N. Enol. J. Med. 311(25): 1606-11 (1984); Krivit, et al., Int. Pediat. 7:47-52 (1992)). El BMT no está disponible de manera universal por la falta de un donante adecuado y se asocia con morbimortalidad sustancial. El Grupo Europeo para Trasplante de Médula Ósea notificó mortalidad relacionada con el trasplante del 10% (HLA idéntico) al 20-25% (HLA erróneo) para 63 casos de trasplante de trastornos lisosómicos (Hoogerbrugge, et al., Lancer 345: 1398-1402 (1995)). Aparte del BMT, la mayoría de los pacientes reciben tratamiento sintomático por problemas específicos como única forma de atención. Un objeto de la presente invención es proporcionar terapia de sustitución enzimática con A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana recombinante (rhASB). No se han realizado intentos para tratar seres humanos con rhASB. Asimismo, no se han proporcionado formulaciones médicas ni dosificaciones clínicas aceptables. Se han realizado varios ensayos de sustitución enzimática del modelo felino de MPS VI.

Sumario de la invención

La presente invención engloba la producción, purificación y el uso de una composición que comprende una N- acetilgalactosamlna-4-sulfatasa altamente purificada en forma de precursor. El ADN y la secuencia codificada de aminoácidos de la forma precursora se exponen en las SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. Se prevé que la secuencia señal son los aminoácidos 1-38 de la SEQ ID NO: 2, y la producción recombinante ha dado como resultado un producto que comienza en el residuo de aminoácido o bien 39 o bien 40 de la SEQ ID NO: 2.

En un primer aspecto, la presente invención presenta composiciones novedosas para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas total o parcialmente por una deficiencia en A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB). Un uso comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica a un sujeto que necesite un tratamiento de este tipo. En la realización preferida, la composición farmacéutica comprende A/-acetilgalactosamina-

4-sulfatasa altamente purificada en forma de precursor, o un fragmento, mutante o análogo biológicamente activo de la misma sola o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. El sujeto padece una enfermedad causada total o parcialmente por una deficiencia de A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa. En otras realizaciones, este método presenta la transferencia de un ácido nucleico que codifica toda o una parte de la A/-acetilgalactosamina-4- sulfatasa (ASB) o un mutante o análogo biológicamente activo de la misma en una o más células huésped in vivo.

Las realizaciones preferidas incluyen optimizar la dosificación respecto a las necesidades del organismo que se va a tratar, preferentemente mamíferos o seres humanos, para mejorar eficazmente los síntomas de la enfermedad. En las realizaciones preferidas, la enfermedad es mucopolisacaridosis VI (MPS VI) o el síndrome de Maroteaux-Lamy.

Este primer aspecto, de la invención proporciona específicamente una composición que comprende N- acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora, en la que dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de fase inversa HPLC (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadamente 47-48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie, opcionalmente en la que dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora es una A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora recombinante. Por lo tanto, la invención contempla el uso de una composición de la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una deficiencia en la actividad de ASB, así como también una composición farmacéutica que contenga una composición de la presente invención para su uso en el tratamiento de una deficiencia en la actividad de ASB. La deficiencia en la actividad de ASB puede observarse, por ejemplo, como niveles de actividad del 50% o menos, el 25% o menos o el 10% o menos en comparación con los niveles normales de actividad de ASB y puede manifestarse como una mucopolisacaridosis, por ejemplo mucopolisacaridosis VI (MPS VI) o síndrome de Maroteaux-Lamy. La cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para proporcionar un efecto beneficioso en el paciente humano y preferiblemente proporciona mejoras en uno cualquiera de los siguientes: movilidad, dolor o rigidez articular, ya sea subjetiva u objetivamente; tolerancia o resistencia al ejercicio, por ejemplo, tal como se mide por la capacidad para caminar o subir; función pulmonar, por ejemplo, tal como se mide mediante FVC, FEVi o FET; agudeza visual; o actividades de la vida diaria, por ejemplo, tal como se mide por la capacidad para levantarse desde la posición sentada, ponerse o quitarse ropa o recoger pequeños objetos. La ASB humana se administra preferiblemente como una preparación recombinante altamente purificada tal como se describe en el presente documento. Las preparaciones preferidas contienen rhASB con una pureza mayor del 99%, 99,2%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9%, tal como se mide mediante HPLC de fase inversa. Las preparaciones preferidas también contienen la forma precursora de ASB a alta pureza, de modo que las formas procesadas... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora, en la que dicha N- acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de fase inversa HPLC (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadamente 47-48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora es una A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora recombinante.

3. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al, o mayor del 99,2% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de RP-HPLC, o en la que dicha pureza es al menos igual al, o mayor del 99,5%, o en la que dicha pureza es igual al, o mayor del 99,9%.

4. Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora está glicosilada.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha A/-acetilgalactosamina-4- sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al, o mayor del 99% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de HPLC con cromatografía de exclusión molecular (SEC-HPLC), o en la que dicha pureza por SEC-HPLC es igual al, o mayor del 99,5%, o en la que dicha pureza por RP-HPLC es igual al, o mayor del 99% y dicha pureza por SEC-HPLC es igual al, o superior al 99,5%.

6. Composición farmacéutica que comprende la composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende además una disolución de cloruro de sodio y un detergente no iónico.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que la A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora está presente a una concentración de aproximadamente 1-5 mg/ml o de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 unidades por mi.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el tampón es un tampón fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 10-50 mM.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el pH de la disolución se mantiene a aproximadamente 5,8.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende un polioxietilensorbitano.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, en la que el polioxietilensorbitano es polioxietilensorbitano 20 u 80 y la concentración de dicho polioxietilensorbitano 20 u 80 es de aproximadamente el 0,005% (peso/volumen).

13. Composición de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento de una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia en A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, en donde la enfermedad es mucopolisacaridosis, MSP VI, o el síndrome de Maroteaux-Lamy.

14. Composición para el uso de la reivindicación 13, en donde dicho paciente tiene aproximadamente un 10% o menos de una actividad de A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa normal.

15. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad producida en su totalidad o en parte por una deficiencia en A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, en donde la enfermedad es mucopolisacaridosis, MPS VI o síndrome de Maroteaux-Lamy.

16. Uso según la reivindicación 15 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, en donde han de administrarse al menos aproximadamente 50 unidades/kg o al menos aproximadamente 1 mg/kg de dicha N- acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora semanalmente a dicho paciente o en donde han de administrarse al menos aproximadamente 100 unidades o 2,0 mg/kg de dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora semanalmente a dicho paciente.

17. Uso según la reivindicación 15 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, en donde el medicamento es para el tratamiento de un ser humano.

18. Uso según la reivindicación 15 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, en donde la cantidad de dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora es eficaz para proporcionar uno o más

efectos beneficiosos seleccionados del grupo que consiste en movilidad articular, dolor articular, rigidez articular, tolerancia al ejercicio, resistencia al ejercicio, función pulmonar, agudeza visual y actividades de la vida diaria.

19. Composición farmacéutica que comprende A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un polioxietilensorbitano a una concentración que oscila entre

aproximadamente el 0,002% y aproximadamente el 0,008% (peso/volumen).

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que dicho polioxietilensorbitano es polioxietilensorbitano 80 a una concentración del 0,005% (peso/volumen).

21. Uso de la reivindicación 15 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el

medicamento es para el tratamiento de un ser humano y dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a una dosis de al menos 0,2 mg/kg por semana, o donde dicha N- acetilgalactosamina humana precursora ha de administrarse a una dosis de 1 mg/kg por semana.

22. Uso según la reivindicación 15 o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, en donde

dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a través de una infusión una vez a la semana a lo largo de un periodo de 2 a 4 horas o en donde dicha A/-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora ha de administrarse a través de una infusión una vez a la semana a lo largo de un periodo de 4 horas.