Fabricación de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana, altamente fosforilada, activa, y usos de la misma.

Un método de purificación de una enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana recombinante,

comprendiendo dicha enzima GALNS una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, en el que dicha enzima GALNS:

tiene una pureza de al menos 95 %, determinada por tinción con azul de Coomassie, cuando se somete a una SDS-PAGE en condiciones no reductoras,

tiene una conversión de al menos 50 % del resto de cisteína en la posición 53 en Cα -formilglicina (FGly), y tiene entre 0,5 y 0,8 cadenas de oligomanosa bis-fosforilada por cadena de proteína monomérica, y en el que al menos el 98 % de dicha enzima GALNS está en forma precursora, determinada por electroforesis capilar en gel con dodecil sulfato sódico (SDS-CGE), que comprende:

a) la filtración de un medio de cultivo que contiene la enzima GALNS segregada de una línea celular de mamífero que expresa el factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano y la enzima GALNS humana recombinante, la ultrafiltración/diafiltración del medio de cultivo filtrado, mediante el cual el medio de cultivo ultrafiltrado/diafiltrado se concentra a aproximadamente 20X, y la filtración en carbón vegetal del medio de cultivo ultrafiltrado/diafiltrado 20 X concentrado;

b) la carga del medio del cultivo ultrafiltrado/diafiltrado 20X filtrado en carbón vegetal de la etapa a) en una columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna y la elución de la enzima GALNS de la columna;

c) la filtración del eluato de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn en la etapa b) a través de un filtro para eliminar los virus;

d) el ajuste del pH del eluato del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn de la etapa c) a aproximadamente pH 4,5 ± 0,1 y la filtración del eluato del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn ajustado a pH 4,5;

e) la carga del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn ajustado a pH 4,5 de la etapa d) en una columna de intercambio de cationes Fractogel EMD SE Hi-Cap, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna, y la elución de la enzima GALNS de la columna;

f) el ajuste del pH del eluato de la columna de intercambio de cationes Fractogel EMD SE Hi-Cap de la etapa e) a aproximadamente pH 3,5 ± 0,1 para la inactivación de virus;

g) el ajuste del eluato que ha experimentado inactivación de virus a pH 3,5 de la etapa f) a aproximadamente pH 5,0, después la carga del eluato que ha experimentado inactivación de virus ajustado a pH 5,0 en una columna de pulido ToyoPearl Butyl 650 M, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna, y la elución de la enzima GALNS de la columna;

h) el cambio de tampón del eluato de la columna de pulido ToyoPearl Butyl 650 M de la etapa g) en una formulación que comprende NaOAc/HOAc 20 mM, NaH2PO4 50 mM, HCl arginina 30 mM, sorbitol al 2 % (p/v), pH 5,4 y el ajuste de la concentración de la enzima GALNS en la formulación a aproximadamente 3 mg/ml;

i) la retirada de cualquier virus y/o ADN residual filtrando la formulación cuyo tampón se ha cambiado en la etapa

h) con un filtro DV20 y un filtro Mustang Q; y

j) la adición de polisorbato 20 (PS20) a la formulación en la etapa i) a una concentración final de 0,01 % (p/v).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2011/045011.

Solicitante: BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 105 DIGITAL DRIVE NOVATO, CA 94949 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: OKHAMAFE,Augustus,O, VELLARD,MICHEL CLAUDE, KOPPAKA,VISH, ARAYA,KIDISTI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/46 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Hidrolasas (3).
  • C12N9/16 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces éster (3.1).

PDF original: ES-2616263_T3.pdf

 

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