Fabricación de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana, altamente fosforilada, activa, y usos de la misma.

Un método de purificación de una enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS) humana recombinante,

comprendiendo dicha enzima GALNS una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a los aminoácidos 27 a 522 de SEQ ID NO: 4, en el que dicha enzima GALNS:

tiene una pureza de al menos 95 %, determinada por tinción con azul de Coomassie, cuando se somete a una SDS-PAGE en condiciones no reductoras,

tiene una conversión de al menos 50 % del resto de cisteína en la posición 53 en Cα -formilglicina (FGly), y tiene entre 0,5 y 0,8 cadenas de oligomanosa bis-fosforilada por cadena de proteína monomérica, y en el que al menos el 98 % de dicha enzima GALNS está en forma precursora, determinada por electroforesis capilar en gel con dodecil sulfato sódico (SDS-CGE), que comprende:

a) la filtración de un medio de cultivo que contiene la enzima GALNS segregada de una línea celular de mamífero que expresa el factor de modificación 1 de sulfatasas (SUMF1) humano y la enzima GALNS humana recombinante, la ultrafiltración/diafiltración del medio de cultivo filtrado, mediante el cual el medio de cultivo ultrafiltrado/diafiltrado se concentra a aproximadamente 20X, y la filtración en carbón vegetal del medio de cultivo ultrafiltrado/diafiltrado 20 X concentrado;

b) la carga del medio del cultivo ultrafiltrado/diafiltrado 20X filtrado en carbón vegetal de la etapa a) en una columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna y la elución de la enzima GALNS de la columna;

c) la filtración del eluato de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn en la etapa b) a través de un filtro para eliminar los virus;

d) el ajuste del pH del eluato del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn de la etapa c) a aproximadamente pH 4,5 ± 0,1 y la filtración del eluato del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn ajustado a pH 4,5;

e) la carga del filtrado de la columna de captura de Sefarosa FF quelante con Zn ajustado a pH 4,5 de la etapa d) en una columna de intercambio de cationes Fractogel EMD SE Hi-Cap, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna, y la elución de la enzima GALNS de la columna;

f) el ajuste del pH del eluato de la columna de intercambio de cationes Fractogel EMD SE Hi-Cap de la etapa e) a aproximadamente pH 3,5 ± 0,1 para la inactivación de virus;

g) el ajuste del eluato que ha experimentado inactivación de virus a pH 3,5 de la etapa f) a aproximadamente pH 5,0, después la carga del eluato que ha experimentado inactivación de virus ajustado a pH 5,0 en una columna de pulido ToyoPearl Butyl 650 M, el lavado de la columna en condiciones tales que la enzima GALNS se retenga en la columna, y la elución de la enzima GALNS de la columna;

h) el cambio de tampón del eluato de la columna de pulido ToyoPearl Butyl 650 M de la etapa g) en una formulación que comprende NaOAc/HOAc 20 mM, NaH2PO4 50 mM, HCl arginina 30 mM, sorbitol al 2 % (p/v), pH 5,4 y el ajuste de la concentración de la enzima GALNS en la formulación a aproximadamente 3 mg/ml;

i) la retirada de cualquier virus y/o ADN residual filtrando la formulación cuyo tampón se ha cambiado en la etapa

h) con un filtro DV20 y un filtro Mustang Q; y

j) la adición de polisorbato 20 (PS20) a la formulación en la etapa i) a una concentración final de 0,01 % (p/v).