Molécula de ARNnpU1 humana modificada, gen que codifica para la molécula de ARNnpU1 humana modificada, vector de expresión que incluye el gen y el uso del mismo en terapia génica.

Una molécula de ARNnpU1 humana modificada, que puede corregir el salto de un exón provocado por una mutación localizada en la secuencia comprendida entre 50 pares de bases en el sentido de 5' y 20 pares de bases en el sentido de 3' de un exón,

caracterizándose la molécula de ARNnpU1 humana modificada porque una parte de la secuencia monocatenaria de nucleótidos de la región en 5' del ARNnpU1 humano silvestre se reemplaza por una secuencia monocatenaria de unión de nucleótidos que puede hibridarse con una secuencia de nucleótidos diana en el pre-ARNm transcrito de un gen diana de interés terapéutico que porta una mutación que induce salto de exón, que se selecciona del grupo que consiste en mutaciones en la secuencia comprendida entre 50 pares de bases en el sentido de 5' y 20 pares de bases en el sentido de 3' de un exón, estando la secuencia diana ubicada en una región del pre-ARNm del gen diana comprendida entre 2 y 50 pares de bases en el sentido de 3' de un sitio de unión exón/intrón, cuyo corte y empalme se ve afectado por dicha mutación.

Molécula de ARNnpUl humana modificada, gen que codifica para la molécula de ARNnpUl humana modificada, vector de expresión que Incluye el gen y el uso del mismo en terapia gènica

La presente Invención se refiere a moléculas de ARNnp humanas modificadas (a continuación en el presente documento designadas como U1 especificas de exón, ExSpeUl), que son adecuadas para usarse en métodos de terapia gènica. En particular, la Invención se refiere a moléculas de ARNnp que pueden corregir procesos de corte y empalme aberrantes provocados por mutaciones genéticas y relacionados con enfermedades humanas con diferentes historiales clínicos, que son a menudo muy graves.

Muchas enfermedades genéticas humanas (aproximadamente el 15%) están provocadas permutaciones genéticas que, al Interferir en la maduración ¡ntracelular correcta del ARN mensajero, comprometen la posterior blosíntesis de proteínas exacta e Inducen la síntesis de proteínas no funcionales. Principalmente, las mutaciones puntuales responsables de defectos de corte y empalme se producen en secuencias génlcas que son críticas para el reconocimiento del transcrito primarlo por la maquinarla destinada al procesamiento del mismo. Los sitios donador y aceptor ubicados en los límites exón-lntrón, así como elementos reguladores específicos de gen en exones o ¡ntrones (Cartegni L ef a/., 2002; Pagan! ef a/., 2004) están entre las secuencias más significativas. Como consecuencia de estas mutaciones, pueden Inducirse diversos acontecimientos moleculares, que lo más frecuentemente producen la exclusión de un exón del transcrito maduro, el denominado salto de exón.

Se sabe desde hace mucho tiempo que cambios moleculares en el procesamiento del ARN mensajero, que implican por ejemplo salto de exón, representan el mecanismo etlopatógeno principal de diversas enfermedades humanas, entre las cuales se encuentran la hemofilia B, flbrosls quístlca y atrofia muscular espinal, que comparten la gravedad de su evolución clínica. Diferente tipos de mutaciones pueden Inducir salto de exón, y específicamente mutaciones en el sitio donador (o sitio de corte y empalme en 5'), mutaciones en el sitio aceptor (sitio de corte y empalme en 3') o mutaciones exónlcas. Como ejemplos de diferentes tipos de mutaciones que inducen salto de exón, a continuación se describen tres modelos de enfermedades humanas.

El defecto en el factor de coagulación IX (FIX) explica la aparición de hemofilia B, una enfermedad a la que acompañan grados variables de manifestaciones hemorráglcas, algunas veces muy graves e incapacitantes. En algunos casos, la enfermedad está provocada por defectos de corte y empalme. En particular, la exclusión del exón 5 del ARNm durante el proceso de corte y empalme está provocado tanto por mutaciones en la posición -2 dentro del sitio donador del exón 5 del gen del factor IX (F9), como por mutaciones en las posiciones -8 y -9 dentro de la secuencia de poll-plrlmldlna en el sitio aceptor.

Las limitaciones de la terapia actual para la hemofilia B, que se basa principalmente en la infusión frecuente de FIX exógeno recomblnante o de FIX derivado directamente de plasma, ponen de relieve la necesidad de desarrollar enfoques alternativos que se caractericen por una mayor eficacia y un efecto de larga duración.

La flbrosls quístlca (CF) es la enfermedad hereditaria congènita mortal más frecuente en la población de raza blanca: un recién nacido de cada 2500-2700 lactantes nacidos vivos se ve afectado por la misma.

La patogenia de esta enfermedad es secundarla a una anomalía de una proteina designada como CFTR (regulador de la conductancia transmembrana de la flbrosls quístlca, Cysf/c Bóros/s Transmemórane Conducfance Regu/afor) ubicado en la membrana apical de células epiteliales y que tiene la función de regular los Intercambios hldroelectrolítlcos.

Como consecuencia de la modificación de CFTR, la transferencia de sales a través de las membranas celulares se ve comprometida, provocando principalmente una producción de secreciones que podrían definirse como "deshidratado": un sudor muy rico en sodio y cloro y una mucosldad densa y viscosa que tiende a obstruir los conductos, comprometiendo la función de diversos órganos y sistemas. En el transcurso de varios estudios, se Identificaron muchas modificaciones en la secuencia gènica de CFTR asociadas con flbrosls quístlca, que Inducen salto de exón. En particular, el salto del exón 12 está provocado tanto por mutaciones ubicadas dentro del sitio donador de corte y empalme del propio exón, como por mutaciones exónlcas.

La atrofia muscular espinal (SMA, OMIM 253300, 253550 y 253400) es una enfermedad neuromuscular autosómlca recesiva caracterizada por degeneración de motoneuronas alfa de la médula espinal, con una prevalencla estimada de 1/10.000 nacidos. SMA está asociada con síndromes clínicos que van de extremadamente graves, con ¡"¡Ipotonia muscular crítica y debilidad desde el nacimiento, a formas más leves en las que la aparición se produce más tarde durante la Infancia o la adolescencia. Hasta la fecha, no se ha Identificado aún ningún tratamiento para esta enfermedad, que conduce generalmente a la muerte a una edad que depende de la gravedad del historial clínico.

En el 95% de los casos, la enfermedad está provocada por la ausencia del gen de SMN1. En el genoma humano, hay un gen homólogo a SMN1 denominado SMN2. Sin embargo, la expresión de SMN2 se ve alterada por una mutación sinónima en el exón que da como resultado una maduración aberrante del ARN mensajero con el consiguiente salto del exón 7 y la inactivación del propio gen. Enfoques diseñados para aumentar el número de transcritos de SMN2 que contienen el exón 7 permitirían por tanto aplicar una terapia de compensación para la

ausencia del gen de SMN1 gracias a la expresión correcta de SMN2, con considerables Implicaciones para un posible tratamiento eficaz para SMA.

Durante el proceso de corte y empalme, los ARN nucleares pequeños (ARNnp) desempeñan un papel importante como componentes esenciales del espllceosoma, la maquinarla celular destinada a mediar en todo el proceso de maduración del ARNm. En particular, el ARN pequeño U1 (ARNnpUl), de 164 rlbonucleótidos de longitud, está codificado por genes que aparecen en varias coplas dentro del genoma humano y representa el componente ribonucleico de la partícula nuclear RNPnpUI. Las moléculas de ARNnpUl tienen una estructura tridimensional de tallo y bucle y dentro de la región 5' Incluyen una secuencia monocatenaria, generalmente de 9 nucleótidos de longitud, que puede unirse por apareamiento de bases complementarlas al sitio donador de corte y empalme en la molécula de pre-ARNm (Horowitz ef a/., 1994). La figura 1 muestra una representación esquemática de la estructura de ARNnpUl silvestre. La secuencia en la reglón 5' que puede reconocer el sitio donador de corte y empalme se muestra apareada con la secuencia consenso del sitio donador de corte y empalme en los transcritos primarios de genes eucariotas. Una secuencia de este tipo presenta grados variables de conservación y está ubicada en la unión exón/lntrón. El reconocimiento mediado por la reglón en 5' de ARNnpUl es crítico para definir las uniones exón/lntrón en el transcrito primario y para un correcto ensamblaje del complejo del espllceosoma.

El creciente número de enfermedades genéticas humanas asociadas con defectos de corte y empalme del pre- ARNm, y la frecuente gravedad de la evolución clínica de las mismas, estimuló en los últimos años la investigación de moléculas terapéuticas dirigidas a corregir defectos de corte y empalme a nivel molecular.

El uso de moléculas de ARNnpUl modificadas que pueden Inducir /n v/fro la Inclusión correcta del exón y la restauración del corte y empalme correcto del ARNm de factor de coagulación Vil en el caso de mutaciones ubicadas en el sitio 5'ss se describe en Pinotti M ef a/. 2008 y Plnottl M ef a/., 2009. El mecanismo ¡lustrado se basa en el reconocimiento y la unión del ARNnpUl modificado directamente sobre el sitio de corte y empalme mutado en 5'. Sin embargo, este método presenta un cierto grado de no especificidad de acción de la molécula de ARNnp terapéutica hacia el gen diana, debido a la conservación relativa de los sitios 5'ss y el consiguiente riesgo de Interferir en la maduración de transcritos generados a partir de otros genes silvestres funcionales. Además, requiere el uso de un ARNnpUl modificado para cada mutación en 5'ss.

Gorman L, Mercatante DR, Kole R. Restoration of correct splicing of thalassemic beta-globin pre-mRNA by modified U1 snRNAs, J. Blol. Chem. 17 de noviembre de 2000; 275(46):35914-9, dan a conocer una molécula humana de ARNnp U1 caracterizada... [Seguir leyendo]