Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B.

Un oligonucleótido antisentido dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica una apolipoproteína B humana,

en donde dicho oligonucleótido es 100 % complementario de dicha molécula de ácido nucleico y es un oligonucleótido quimérico de cadena simple que tiene 20 nucleótidos de longitud y está compuesto por una región de espacio central que consiste en diez 2'-desoxinucleótidos flanqueados en ambos lados por flancos de cinco nucleótidos compuestos por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos, y en donde las uniones entre nucleósidos son fosforotioato (P≥S) a lo largo del oligonucleótido, y en donde todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas, y en donde dicho oligonucleótido se hibrida específicamente con, e inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B humana, para usar en:

(a) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de lípidos anormal;

(b) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de colesterol anormal;

(c) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es ateroesclerosis;

(d) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es hiperlipidemia;

(e) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es diabetes;

(f) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es obesidad;

(g) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es una enfermedad cardiovascular;

(h) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de glucosa en un animal;

(i) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de colesterol en suero en un animal;

(j) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de lipoproteína en un animal; o (k) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de triglicéridos en suero en un animal.

Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los compuestos y métodos para la modulación de la expresión de la apolipoproteína B. En particular, esta invención se refiere al uso de componentes, especialmente oligonucleótidos, específicamente hibridizables con los ácidos nucléicos que codifican la apolipoproteína B. Tales compuestos han demostrado modular la expresión de la apolipoproteína B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las lipoproteínas son globulares, partículas de tipo micela que constan de un núcleo no polar de acilglicéridos o acilgliceroles y esteres de colesteril rodeados por un recubrimiento anfifílico de proteína, fosfolípido y colesterol. Las lipoproteínas han sido clasificadas en cinco amplias categorías sobre la base de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, que transportan los lípidos alimentarios del intestino a los tejidos; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL por sus sigla en inglés) ; lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) ; lipoproteínas de densidad baja (LDL) ; todas las cuales transportan los triacilgliceroles y el colesterol desde el hígado a los tejidos; y lipoproteíans de alta densidad (HDL) , que transportan el colesterol endógeno desde los tejidos hacia el hígado.

Las partículas de lipoproteínas están sometidas a procesos metabólicos continuos y poseen propiedades y composiciones variables. Las densidades de lipoproteína se incrementan sin disminuir el diámetro de la partícula, porque la densidad de sus revestimientos externos es menor que la del núcleo interior. Los componentes de las lipoproteíans se conocen como apoliproteínas. Al menos nueve apolipoproteínas se distribuyen en cantidades significativas entre las diferentes lipoproteínas humanas.

La Apolipoproteína B (también conocida como ApoB, apolipoproteína B-100, ApoB 100, apolipoproteína B-48, ApoB-48 y Antígeno Ag (x) ) , es una glicoproteína grande que juega un papel indispensable en la formación y la secreción de lípidos y en el transporte y la captación mediada por receptor y el suministro de distintas clases de lipoproteínas. La importancia de la apolipoproteína B abarca una variedad de funciones, a partir de la absorción y procesamiento de los lípidos alimentarios hasta la regulación de los niveles de lipoproteínas circulantes (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) . Esta última propiedad subraya su relevancia en términos de susceptibilidad de arterosclerosis, que se correlaciona notablemente con la concentración en el ambiente de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) .

Existen dos formas de apolipoproteína B en los mamíferos. La ApoB-100 representa la proteína de longitud completa que contiene 4536 residuos de aminoácido sintetizado exclusivamente en el hígado humano (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) . Una forma truncada conocida como ApoB-48 es colineal con los residuos 2152 aminoterminal y se sintetiza en el intestino delgado de todos los mamíferos (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) .

La ApoB-100 es el principal componente proteico de LDL y contiene el campo requerido para interacción de esta especie de lipoproteínas con el receptor LDL. De manera adicional, la ApoB-100 contiene un residuo de cisteína deteriorada que media una interacción con la apolipoproteína (a) y genera otra lipoproteína aterogénica distinta denominada lp (a) (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) .

En los humanos, la ApoB-48 circula en asociación con los quilomicrones y el quilomicrón restos y esas partículas son cleared by un receptor distinto conocido como proteína receptor LDL relacionado (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) . La ApoB-48 puede considerarse como una adaptacion crucial mediante la cual el lípido de la dieta se suministra desde el intestino delgado hacia el hígado, mientras que el ApoB100 participa en el transporte y suministro del colesterol plasmático endógeno (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) .

La base mediante la cual el gen estructural común para la apolipoproteína B produce dos isoformas de proteínas distintos es un proceso conocido como edición del ARN. Un sitio específico citosina-uracilo edición reacción produce una detención del UAA del codón y terminación translational de la apolipoproteína B para producir ApoB-48 (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193) .

La apolipoproteína B se clonó en 1985 (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82, 8340-8344) y localizado en el cromosoma 2p23-2p24 en 1986 (Deeb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 419-422) .

En la patente estadounidense 5.786.206, se describieron y publicaron métodos y composiciones para determinar el nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el plasma que incluyen secuencuencias aisladas de ADN que codifican las regiones epítopo de la apolipoproteína B-100 (Smit et al., 1998) .

Se encontró que los ratones transgénicos que expresan la apolipoproteína B humana y alimentados con

una dieta alta en grasas desarrollaron altos niveles de colesterol plasmático y desplegaron un aumento de en 11 veces las lesiones ateroscleróticas con respecto a los compañeros de camada no transgénicos (Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869) .

De manera adicional, se utilizaron ratones transgénicos que expresan formas truncadas de apolipoproteína B humana, para identificar las características estructurales del terminal de carboxilo del ApoB-100 que se requieren para la interacciones con la apolipoproteína (a) para generar la partícula de lipoproteína Lp (a) y para investigar las características estructurales del a región de unión al repector del LDL de la ApoB-100 (Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; McCormick et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 23616-23622) .

La apolipoproteína B de los ratones eliminados (bearing disruptions tanto del ApoB-100 como del ApoB48) se han generado que estén protegidos de desarrollar hipercolesterolemia cuando reciben una alimentación alta en grasas (Faresse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, 92, 1774-1778; Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703723) . Se ha investigado la incidencia de la aterosclerosis en ratones que expresan exclusivamente ApoB-100 o ApoB-48 y se detectó que la susceptibilidad a la aterosclerosis dependería de los niveles de colesterol total. Mientras que los ratones con ApoB-100 o ApoB-48 sintetizada no afectaron el grado de la aterosclerosis, lo que indica que probablemente no hay mayor diferencia en la aterogenecidad intrínseca del ApoB-100 en comparación con el ApoB48 (Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Veniant et al., J. Clín. Invest., 1997, 100, 180-188) .

Los altos niveles plasmáticos de la lipoproteín Lp (a) se asocian con el riesgo creciente de aterosclerosis y sus manifestaciones, que pueden incluir hipercolesterolemia (Seed et al. , N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499) , infarto al miocardio (Sandkamp et al., Clin. Chem., 1990, 36, 20-23) y trombosis (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, E11) .

La concentración de plasma de la Lp (a) está fuertement influenciada por factores hereditarios y es refractario a la mayoría de las drogas y la manipulación dietética (Katan y Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71) . La terapia farmacológica de altos niveles de Lp (a) solo ha sido modestamente exitosa y la aféresis sigue siendo el la modalidad terapéutica más efectiva (Hajjar and Nachmanm, Annu. Rev. Med., 1996, 47, 423-442) .

En la patente estadounidense 6.156.315 y la correspondiente publicación PCT WO99/18986 se describen y reivindican un método para inhibir la nión del LDL a la matriz de los vasos sanguíneos en un sujeto, que comprendía la administración de un anticuerpo o frangemento del mismo, que es capaz de unir a la región aminoterminal de la apolipoproteína B, inhibiendo de este modo la unión de la lipoproteína de baja densidad a la matriz de vasos sanguíneos. (Goldberg and Pillarisetti, 2000; Goldberg and Pillarisetti, 1999) .

En la patente estadounidense 6.096.516 se describen los vectores que contienen ADNc que condifica anticuerpos recombinantes murinos que se unen a la ApoB-1000 humana con el objetivo de diagnosticar y tratar las enfermedades cardiovasculares. (Kwak et al., 2000) .

Lo que se describe y reivindica en la publicación PCT EP 911344 es un anticuerpo monoclonal que une de manera específica a... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica una apolipoproteína B humana, en donde dicho oligonucleótido es 100 % complementario de dicha molécula de ácido nucleico y es un oligonucleótido quimérico de cadena simple que tiene 20 nucleótidos de longitud y está compuesto por una región de espacio central que consiste en die.

2. desoxinucleótidos flanqueados en ambos lados por flancos de cinco nucleótidos compuestos po.

2. metoxietil (2-MOE) nucleótidos, y en donde las uniones entre nucleósidos son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido, y en donde todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas, y en donde dicho oligonucleótido se hibrida específicamente con, e inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B humana, para usar en:

(a) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de lípidos anormal;

(b) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de colesterol anormal;

(c) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es ateroesclerosis;

(d) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es hiperlipidemia;

(e) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es diabetes;

(f) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es obesidad;

(g) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es una enfermedad cardiovascular;

(h) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de glucosa en un animal;

(i) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de colesterol en suero en un animal;

(j) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de lipoproteína en un animal; o

(k) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de triglicéridos en suero en un animal.

2. El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 (e) , en donde la diabetes es diabetes de tipo 2.

3. El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 (h) , en donde los niveles de glucosa son niveles de glucosa en plasma.

4. El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 (h) , en donde los niveles de glucosa son niveles de glucosa en suero.

5. El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 (h) , en donde el animal es un animal diabético.

6. El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 (j) , en donde la lipoproteína es VLDL.

7. El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 (j) , en donde la lipoproteína es LDL.

8. El oligonucleótido antisentido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el animal es un humano.