Modelos de animales y moléculas terapéuticas.

Procedimiento para producir una célula ES de ratón que comprende regiones VDJ de humano,

en donde el procedimiento comprende insertar en un genoma de célula ES de ratón

(a) (i) un casete de iniciación que comprende una secuencia de esqueleto de ADN de BAC que sirve de sitio diana para la inserción de una secuencia homóloga y (ii) una secuencia homóloga al sitio de inserción deseado del sitio diana en el locus de IgH del genoma de ratón, en donde la secuencia del esqueleto se inserta mediante recombinación homóloga de la secuencia homóloga al sitio deseado de inserción con la secuencia homóloga de ratón en el genoma de la célula ES y

(b) una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano insertadas en el locus de IgH de ratón por delante de una región constante de ratón;

en donde las regiones de IgH de la etapa (b) están en una secuencia de esqueleto de vector de un vector, en donde la secuencia del esqueleto es la misma secuencia de esqueleto que el casete de iniciación y en donde las regiones de IgH se insertan por recombinación del vector con el sitio diana de la etapa (a), la inserción se lleva a cabo por etapas con 2 o más inserciones independientes y la inserción de las regiones de IgH dan lugar a una disposición funcional con la región constante de ratón para el anticuerpo o la producción de la cadena del anticuerpo y en donde el procedimiento de inserción comienza en el sitio donde el casete de iniciación se ha insertado en el genoma de la célula ES que proporciona una región destinataria única.

Modelos de animales y moléculas terapéuticas Antecedentes La presente invención se refiere, entre otros, a células y animales no humanos que se modifican genéticamente para que contengan ADN exógeno, tal como ADN de gen de inmunoglobulina humana, su uso en medicina y el estudio de la enfermedad, procedimientos para la producción de células y animales no humanos, y anticuerpos y cadenas de anticuerpos producidos por tales animales y derivados de los mismos.

Para solventar los problemas de la humanización de los anticuerpos, una serie de compañías empezaron a generar ratones con sistemas inmunitarios humanos. La estrategia utilizada fue genosuprimir los locus de la cadena ligera y de la cadena pesada en las células ES y complementar estas lesiones genéticas con transgenes diseñados para que expresen los genes humanos de las cadenas ligera y pesada. Aunque se podían generar anticuerpos completamente humanos, estos modelos tienen varias limitaciones importantes:

(i) El tamaño de los locus de las cadenas pesada y ligera (cada uno de varias Mb) hacía imposible introducir todo el locus en estos modelos. Como resultado, las líneas transgénicas recuperadas tenían un repertorio muy escaso de regiones V, la mayoría de las regiones constantes estaban ausentes y en los transgenes no se incluyeron las regiones potenciadoras importantes distales.

(ii) La bajísima eficiencia a la hora de generar las líneas transgénicas con un gran inserto y la complejidad y el tiempo necesarios para cruzar cada una de éstas con las cepas que tienen genosuprimidas las cadenas ligera y pesada y hacerlas de nuevo homocigotas restringió el número de líneas transgénicas que se

pudieron analizar en busca de la expresión óptima.

(iii) La afinidad de cada uno de los anticuerpos raramente alcanzaba la que se podía obtener con animales (no transgénicos) intactos.

La patente internacional WO 2007117410 describe construcciones quiméricas para expresar anticuerpos quiméricos.

La patente internacional WO 2010039900 describe el bloqueo en las células y mamíferos que tienen un genoma que 25 codifica anticuerpos quiméricos.

La presente invención da a conocer, entre otros, un procedimiento para que los mamíferos no humanos generen anticuerpos que comprenden una región variable de Ig de humano, y además da a conocer modelos de animales no humanos para generar tales anticuerpos.

Compendio de la invención.

En un aspecto la invención se refiere a un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 16.

En la presente memoria también se describen:

Un mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a) una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; y (b) opcionalmente una o varias regiones V de la cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante de la del mamífero no humano hospedador y/o una o varias regiones V de la cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de la cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; respectivamente, en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos o cadenas ligera o pesada quiméricas que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

Un mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a) una serie de regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador y/o una serie de regiones V

de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; y (b) opcionalmente una o varias regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias

regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador;

en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos o de cadenas ligera

o pesada quiméricas, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano.

Una célula de mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a) una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador y

(b) opcionalmente una o varias regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador y/o una o varias regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador.

Una célula de mamífero no humano cuyo genoma comprende:

(a) una serie de regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador y/o una serie de regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; y

(b) opcionalmente una o varias regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador;

Un procedimiento para producir una célula no humana o mamífero que comprende insertar en un genoma de célula de mamífero no humano, tal como un genoma de célula ES:

(a) una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; y

(b) opcionalmente una o varias regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador y/o una o varias regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano por delante de la región constante del mamífero no humano hospedador; respectivamente;

en donde la inserción es tal que la célula o el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable de humano, en donde las etapas (a) y (b) se pueden llevar a cabo en cualquier orden y cada una de las etapas (a) y (b) se pueden llevar a cabo por etapas o como una única etapa.

La inserción puede ser mediante recombinación homóloga.

Un procedimiento para producir un anticuerpo o cadena de anticuerpo específico contra un antígeno deseado, en donde el procedimiento comprende inmunizar un mamífero no humano transgénico tal y como el descrito en la presente memoria con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o cadena de anticuerpo.

Un procedimiento para producir un anticuerpo completamente humanizado que comprende inmunizar un mamífero no humano transgénico como el descrito en la presente memoria con el antígeno deseado, recuperar el anticuerpo o las células que producen el anticuerpo y luego reemplazar la región constante del mamífero no humano con una región constante de humano, por ejemplo, mediante manipulación genética del ADN o de la proteína.

Los anticuerpos humanizados y las cadenas de anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención, tanto en la forma quimérica (por ejemplo, ratón-humano) como la completamente humanizada, así como los fragmentos y derivados de dichos anticuerpos y cadenas, y el uso de dichos anticuerpos, cadenas y fragmentos en la medicina, incluido el diagnóstico.

Uso de un mamífero no humano tal y como se describe en la presente memoria como modelo para ensayar fármacos y vacunas.

Figuras Las figuras 1 a 8 muestran un procedimiento repetitivo para la inserción de una serie de BAC de humano en un locus de Ig de ratón.

Las figuras 9 a 18 muestran con más detalle el procedimiento de las figuras 1 a 8 para los locus IgH y .

Las figuras 19 y 20 muestran los principios en los que se basa la generación de anticuerpos con ratones quiméricos. La figura 21 muestra un posible sitio de inserción para el ADN humano en un cromosoma de ratón. Las figuras 22 a 26 describen un procedimiento repetitivo alternativo para la inserción de una serie de BAC de humano... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir una célula ES de ratón que comprende regiones VDJ de humano, en donde el procedimiento comprende insertar en un genoma de célula ES de ratón

(a) (i) un casete de iniciación que comprende una secuencia de esqueleto de ADN de BAC que sirve de sitio diana para la inserción de una secuencia homóloga y (ii) una secuencia homóloga al sitio de inserción deseado del sitio diana en el locus de IgH del genoma de ratón, en donde la secuencia del esqueleto se inserta mediante recombinación homóloga de la secuencia homóloga al sitio deseado de inserción con la secuencia homóloga de ratón en el genoma de la célula ES y

(b) una serie de regiones V de IgH de humano, una o varias regiones D de humano y una o varias regiones J de humano insertadas en el locus de IgH de ratón por delante de una región constante de ratón;

en donde las regiones de IgH de la etapa (b) están en una secuencia de esqueleto de vector de un vector, en donde la secuencia del esqueleto es la misma secuencia de esqueleto que el casete de iniciación y en donde las regiones de IgH se insertan por recombinación del vector con el sitio diana de la etapa (a) , la inserción se lleva a cabo por etapas con 2 o más inserciones independientes y la inserción de las regiones de IgH dan lugar a una disposición funcional con la región constante de ratón para el anticuerpo o la producción de la cadena del anticuerpo y en donde el procedimiento de inserción comienza en el sitio donde el casete de iniciación se ha insertado en el genoma de la célula ES que proporciona una región destinataria única.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde de 800 a 1000 kb de la región VDJ de IgH de humano se inserta en el locus de IgH de ratón.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la región de IgH insertada comprende las bases

105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano (NCBI36 para el genoma humano, ENSEMBL versión 54) .

4. Procedimiento para producir una célula ES de ratón que comprende las regiones VJ de humano, en donde el procedimiento comprende insertar en un genoma de célula ES de ratón

(a) (i) un casete de iniciación que comprende una secuencia de esqueleto de ADN de BAC que sirve de sitio diana para la inserción de una secuencia homóloga y (ii) una secuencia homóloga al sitio de inserción deseado del sitio diana en un locus de la cadena ligera de Ig del genoma de ratón, en donde la secuencia de esqueleto se inserta por recombinación homóloga de la secuencia homóloga en el sitio deseado de inserción con la secuencia homóloga de ratón en el genoma de célula ES, y

(b) una serie de regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o varias regiones J de cadena ligera de Ig de humano insertadas en el locus de la cadena ligera de Ig de ratón por delante y en disposición funcional con una región constante o de ratón y/o una serie de regiones V de cadena ligera de Ig de humano y una o mas regiones J de cadena ligera de Ig de humano insertadas en el locus de la cadena ligera de Ig de ratón por delante de una región constante o de ratón;

en donde las regiones de cadena ligera de la etapa (b) se encuentran en una secuencia de esqueleto de vector de un vector, en donde la secuencia de esqueleto es la misma secuencia de esqueleto que el casete de iniciación y en donde las regiones de cadena ligera se insertan por recombinación de un esqueleto de vector que comprende el ADN humano de la etapa (b) con el sitio diana de la etapa (a) , la inserción se lleva a cabo por etapas con 2 o más inserciones independientes y la inserción de las regiones de cadena ligera dan lugar a una disposición funcional con la región constante de ratón para el anticuerpo o la producción de la cadena del anticuerpo y en donde el procedimiento de inserción comienza en un sitio donde se ha insertado el casete de iniciación en el genoma de la célula ES y que proporciona una región diana única.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la región VJ insertada comprende las bases 88.940.356 a 89.857.000 del cromosoma 2 humano (NCBI36 para el genoma humano, ENSEMBL versión 54) .

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la inserción en el sitio diana es por recombinación homóloga o por recombinación específica de sitio.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 o más inserciones independientes.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde varios fragmentos de ADN de las regiones de Ig se insertan en la diana del ADN.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el extremo 5' del inserto humano ha aumentado su longitud.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde varios fragmentos de ADN de las regiones de Ig se insertan en el extremo 5' del fragmento anterior insertado y el ADN del vector que separa las secuencias de

ADN de humano insertadas se elimina in vivo mediante la escisión de ADN mediada por transposasa para formar una inserción contigua en la que los fragmentos insertados de las regiones de Ig se yuxtaponen directamente sin quedar interrumpidas por secuencias de ADN del vector.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las inserciones VDJ o VJ de humano se llevan a cabo por recombinación homóloga o por recombinación específica de sitio.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la inserción de la secuencia de esqueleto de ADN de BAC de (a) es por recombinación homóloga y en donde la inserción de (a) va seguida de la inserción mediante RMCE de las regiones VDJ o VJ de humano de (b) en una porción del sitio diana.

13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de esqueleto de ADN de BAC comprende las secuencias diana de recombinasa y después de la inserción de un fragmento de las regiones VDJ o VJ de humano, la secuencia de esqueleto se elimina por recombinación entre las secuencias diana de recombinasa.

14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de ADN de BAC es para dirigir la inserción de un fragmento de las regiones VDJ o VJ de humano.

15. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la inserción 20 comprende una inserción de ADN que comprende un fragmento de VDJ o VJ de más de 100 kb.

16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el extremo 3' del último gen de J de humano a insertar es de menos de 2 kb, opcionalmente de menos de 1 kb, de la región de la unión humano-ratón.