Microorganismo que produce O-acetilhomoserina y método de producción de O-acetilhomoserina usando el microorganismo.

Escherichia coli que puede producir O-acetilhomoserina, caracterizada por que:



a) la Escherichia coli contiene un gen de Deinococcus sp. o Mycobacterium sp. que codifica para un polipéptido que tienen actividad homoserina O-acetiltransferasa; y

b) la Escherichia coli sobreexpresa un gen que codifica para un polipéptido que tiene actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa o expresa un gen que codifica para un polipéptido de aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa mutado de manera que la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa está potenciada.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09157283.

Solicitante: CJ CHEILJEDANG CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 500 NAMDAEMUNRO 5-GA JUNG-GU, SEOUL 100-749 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: CHANG,JIN-SOOK, CHO,YOUNG WOOK, KIM,SO-YOUNG, UM,HYE-WON, HEO,IN KYUNG, SEO,CHANG IL, LEE,HAN JIN, NA,KWANG HO, KIM,CHUL HA, SHIN,YOUNG UK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/53 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
  • C12N15/54 C12N 15/00 […] › Transferasas (2).
  • C12N9/04 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
  • C12N9/10 C12N 9/00 […] › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12N9/12 C12N 9/00 […] › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
  • C12P13/06 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Alanina; Leucina; Isoleucina; Serina; Homoserina.
  • C12P13/12 C12P 13/00 […] › Metionina; Cisteína; Cistina.

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Fragmento de la descripción:

Microorganismo que produce O-acetilhomoserina y método de producción de O-acetilhomoserina usando el microorganismo

Antecedentes

La metionina es uno de los aminoácidos esenciales del cuerpo humano que se ha usado ampliamente como aditivos de piensos y alimentos y se ha usado además como material de partida de síntesis para disoluciones médicas y suministros médicos. La metionina actúa como precursor de compuestos tales como colina (lecitina) y creatina y al mismo tiempo se usa como material de partida de síntesis para cisterna y taurina. La metionina también puede proporcionar azufre. La S-adenosil-metionina se deriva de L-metionina y desempeña un determinado papel en 10 proporcionar grupo metilo en el cuerpo humano y también está implicada en la síntesis de diversos neurotransmisores en el cerebro. La metionina y/o S-adenosil-L-metionina (SAM) inhibe la acumulación de grasa en el hígado y las arterias y alivia la depresión, inflamación, enfermedad hepática y dolor muscular, etc.

Las funciones in vivo de la metionina y/o S-adenosil-L-metionina conocidas hasta la fecha son las siguientes.

1) Inhibe la acumulación de grasa en el hígado y las arterias promoviendo el metabolismo lipídico y mejora la 15 circulación sanguínea en el cerebro, corazón y riñón (J Hepatol. Jeon BR ef al., marzo de 2001; 34(3): 395-401).

2) Promueve la digestión, detoxificación y excreción de sustancias tóxicas y la excreción de metales pesados tales como Pb.

3) Puede administrarse como agente contra la depresión a la dosificación de 800 - 1.600 mg/día (Am J Clin Nutr. Mischoulon D. etal., noviembre de 2002; 76(5): 1158S-61S).

4) Potencia las funciones hepáticas (FASEB J. Mato JM., enero de 2002; 16(1): 15-26) y particularmente es eficaz

en la enfermedad hepática provocada por el alcohol (Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235).

5) Tiene efecto antiinflamatorio sobre enfermedades articulares y óseas y promueve la recuperación articular (ACP J Club. Sander O., enero-febrero de 2003; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., mayo de 2002; 51(5): 425-30).

6) Es un nutriente esencial para el cabello. Proporciona nutrición al cabello y de ese modo previene la alopecia

(Audiol Neurootol., Lockwood DS etal., septiembre-octubre de 2000; 5(5): 263-266).

La metionina puede sintetizarse química o biológicamente para aplicarse a piensos, alimentos y medicamentos.

En la síntesis química, se produce metionina principalmente por hidrólisis de 5-(j5-metilmercaptoetil)-hidantoína. La metionina sintetizada químicamente tiene la desventaja de producirse sólo como una mezcla de tipo L y tipo D.

En la síntesis biológica, se produce metionina mediante el método de uso de proteínas implicadas en la síntesis de metionina. Se biosintetiza L-metionina a partir de homoserina mediante la acción de la enzima expresada por genes tales como as metA, metB, mete, metE y metH, en E. coli. Particularmente, metA es el gen que codifica para homoserina O-succiniltransferasa que es la primera enzima necesaria para la biosíntesis de metionina, y convierte homoserina en O-succinil-L-homoserina. La O-succinilhomoserina liasa o cistationina gamma sintasa codificada por 35 el gen metB convierte O-succinil-L-homoserina en cistationina. La cistationina beta liasa codificada por el gen metC convierte cistationina en L-homocisteína. MetE codifica para metionina sintasa independiente de cobalamina y metH codifica para metionina sintasa dependiente de cobalamina, convirtiendo ambas L-homocisteína en L-metionina. En este momento, la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa codificada por metF y la serina hidroximetiltransferasa codificada por glyA funcionan en conjunto para sintetizar N(5)-metiltetrahidrofolato que proporciona el grupo metilo 40 necesario para la síntesis de L-metionina.

Se sintetiza L-metionina mediante una serie de reacciones orgánicas por las enzimas anteriores. La modificación genética en las proteínas anteriores u otras proteínas que afectan a las proteínas anteriores podría dar como resultado el aumento de la síntesis de L-metionina. Por ejemplo, la publicación de patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2000/139471 describe un método de producción de L-metionina con la Escherichia sp. de 45 la que se delecionan los genes thrBC y metJ en el genoma, se sobreexpresa metBL y se reemplaza metK por un muíante rezumante. Además, la publicación de patente estadounidense n.° US2003/0092026 A1 describe un método de uso de un microorganismo deficiente en metD (inhibidor de la síntesis de L-metionina) que pertenece a Corynebacterium sp. La publicación de patente estadounidense n.° US2002/0049305 describe un método para aumentar la producción de L-metionina aumentando la expresión de 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (metF).

La metionina producida mediante el método biológico es de tipo L, lo que tiene ventajas, pero la cantidad de producción es demasiado pequeña. Esto se debe a que la ruta de biosíntesis de metionina tiene sistemas de regulación por retroalimentación muy estrictos. Una vez que se sintetiza metionina a un determinado nivel, la metionina como producto final inhibe la transcripción del gen metA que codifica para la proteína primaria para el inicio de la biosíntesis de metionina. La sobreexpresión del propio gen metA no puede aumentar la producción de

metionina porque el gen metA se suprime por la metlonlna en la fase de transcripción y luego se degrada por las proteasas ¡ntracelulares en la fase de traducción (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan y Eliora Z. Ron: Control of methlonlne blosynthesls ¡n Escherichia coli by proteolysls: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). Por tanto, muchas de las patentes previas se centraron en cómo liberar el gen metA de su sistema de regulación por retroallmentaclón (documentos W02005/108561, WO1403813).

La publicación de patente estadounidense n.° US2005/0054060A1 describe un método para sintetizar homocisteína o metlonlna mediante cistationina slntasa modificada (O-succinilhomoserlna Nasa) que usa metilmercaptano (CH3SH) o sulfuro de hidrógeno (H2S) directamente como fuente de azufre, no cisterna. Sin embargo, los expertos en la técnica entienden bien que la cistationina slntasa puede unirse a diversos precursores de metionina en las células y de ese modo producir subproducto a alto nivel. Por ejemplo, se notificó que la cistationina sintasa acumula altos niveles de homolantlonlna mediante la reacción secundarla de O-succinlIhomoserina y homocisteína (J. Bacteriol (2006) vol. 188: págs. 609-618). Por tanto, la sobreexpresión de cistationina sintasa puede reducir la eficacia de la reacción ¡ntracelular debido al aumento de su reacción secundaria. Además, este método tiene muchas desventajas. Este procedimiento usa rutas metabóllcas ¡ntracelulares que tienen reacciones secundarias y sistemas de regulación por retroallmentaclón. Además este procedimiento usa H2S o CH3SH que tienen una grave citotoxicidad para las células. Por tanto, el rendimiento de producción de metlonlna es comparativamente pequeño.

Para solucionar estos problemas, el presente Inventor ha desarrollado un procedimiento de dos etapas que comprende; una primera etapa de producción del precursor de L-metlonlna mediante fermentación de £. co//; y una segunda etapa de conversión del precursor de L-metionina en L-metionina mediante reacción enzimática (documento PCT/KR2007/003650). Este procedimiento de dos etapas puede solucionar los problemas anteriores, tales como citotoxicidad de sulfuras, regulación por retroallmentaclón por metionina y SAMe, descomposición del producto Intermedio por enzimas ¡ntracelulares (por ejemplo cistationina gamma sintasa, O-succinilhomoserina sulfhldrllasa y O-acetilhomoserina sulfhldrllasa). Además, en contraposición al método de síntesis química de metlonlna que produce una forma mixta de D-metlonlna y L-metionina, el procedimiento de dos etapas es muy eficaz produciendo sólo L-metlonlna selectivamente.

En este procedimiento de dos etapas, el rendimiento de producción del precursor de metionina es uno de los factores clave para el aumento del rendimiento de producción de metionina. Para aumentar el rendimiento de síntesis del precursor de metlonlna, O-acetlIhomoserina, es realmente importante una buena combinación de aspartoclnasa fuerte, homoserlna transferasa y O-acetlIhomoserina transferasa. Con los antecedentes mencionados anteriormente, los presentes inventores construyeron el precursor de L-metionina produciendo una cepa que se caracteriza por lo siguiente; a) la actividad homoserina O-acetiltransferasa (EC 2.3.1.31) se introduce y se potencia por la integración de genes seleccionados de Corynebacterium... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.

Escheríchia co/i que puede producir O-acetilhomoserina, caracterizada por que:

a) la Escheríchia coli contiene un gen de Deinococcus sp. o Mycobacteríum sp. que codifica para un polipéptido que tienen actividad homoserina O-acetiltransferasa; y

b) la Escheríchia coli sobreexpresa un gen que codifica para un polipéptido que tiene actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa o expresa un gen que codifica para un polipéptido de aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa mutado de manera que la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa está potenciada.

2.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que el gen que codifica para un polipéptido que tiene actividad homoserina O-acetiltransferasa es de Deinococcus radiodurans o Mycobacteríum smegmatis.

3.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que el polipéptido de aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 27.

4.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que se debilita o se inactiva la actividad cistationina gamma sintasa reduciendo o eliminando la expresión del gen o reduciendo o eliminando las propiedades catalíticas

de la proteína expresada.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que se debilita o se inactiva la actividad homoserina cinasa reduciendo o eliminando la expresión del gen o reduciendo o eliminando las propiedades catalíticas de la proteína expresada.

6.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que se debilita o se inactiva el regulador de la transcripción metJ reduciendo o eliminando la expresión del gen o reduciendo o eliminando las propiedades catalíticas de la proteína expresada.

7.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que la Escheríchia coli es la cepa que produce treonina Escheríchia coli MF001 depositada con el número de registro KCCM 10568 que se ha modificado para:

a) contener un gen de Deinococcus sp. o Mycobacteríum sp. que codifica para un polipéptido que tiene actividad homoserina O-acetiltransferasa; y

b) sobreexpresar un gen que codifica para un polipéptido que tiene actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa o expresar un gen que codifica para un polipéptido de aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa mutado de manera que la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa está potenciada.

8.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que la Escheríchia coli es la cepa que produce treonina Escheríchia coli FTR2533 depositada con el número de registro KCCM 10541 que se ha modificado para:

a) contener un gen de Deinococcus sp. o Mycobacteríum sp. que codifica para un polipéptido que tiene actividad homoserina O-acetiltransferasa; y

b) sobreexpresar un gen que codifica para un polipéptido que tiene actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa o expresar un gen que codifica para un polipéptido de aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa mutado de manera que se potencia la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa.

9.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que la Escheríchia coli es CJM-X(pthrA(M)-CL) depositada con el número de registro KCCM 10921P.

10.

Escheríchia coli según la reivindicación 1, en la que la Escheríchia coli es CJM2-X(pthrA(M)-CL) depositada con el número de registro KCCM 10925P.

11.

Método de producción de O-acetilhomoserina, que comprende: a) la fermentación de la Escheríchia coli según cualquier reivindicación seleccionada de la reivindicación 1 a la reivindicación 10; b) el enriquecimiento de la O-acetilhomoserina en el medio o en la Escheríchia coli', y c) el aislamiento de la O-

acetilhomoserina.


 

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