Microensayo rápido de esterilidad.

Un método para pruebas de esterilidad de una composición farmacéutica líquida que comprende:

(a) proporcionar una composición farmacéuticamente filtrable;

(b) filtrar la composición farmacéutica para proporcionar al menos tres membranas de filtro sobre las cuales se deposita el filtrado de la composición farmacéutica;

(c) colocar al menos las tres membranas de filtro en medios sólidos de cultivo para producir al menos tres cultivos de filtrado;

(d) cultivar (i) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas a 20-25 ºC; (ii) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas de 30-35 ºC; y (iii) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones anaeróbicas de 30-35 ºC; con la condición de que ninguno de los cultivo de filtrado se cultive durante un periodo superior a aproximadamente 13 días y

(e) detectar una célula de microorganismo, micro-colonia o colonia viable en una membrana, donde la presencia de una célula de microorganismo, micro-colonia o colonia viable en la membrana indica la presencia de un microorganismo viable en la composición farmacéutica.

detallada de la invención

La invención se refiere a un método para pruebas de esterilidad que es más rápido que las pruebas convencionales, que requieren un periodo de incubación de 14 días. El método es particularmente adecuado para pruebas rápidas de esterilidad de composiciones líquidas filtrables, tales como composiciones farmacéuticas líquidas (por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, composiciones parenterales, composiciones orales, composiciones nasales, composiciones oculares, vacunas). Generalmente, el método incluye filtrar una composición farmacéutica a través de una membrana filtro, la membrana filtro después se transfiere a un medio sólido de cultivo y se incuba bajo condiciones apropiadas de crecimiento durante un tiempo suficiente para permitir microorganismos viables que estén en la membrana para proliferar o producir una cantidad suficiente de una biomolécula, tal como adenosín trifosfato, para permitir la detección de de los microorganismos (por ejemplo 6 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días).

En un aspecto, la invención es un método para pruebas de esterilidad de una composición farmacéutica líquida. El método incluye filtrar una composición farmacéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica líquida) a través de una membrana filtro para proporcionar más de una (por ejemplo, al menos tres) membranas de filtro sobre la que se depositan el filtrado de composición farmacéutica y cualquier microorganismo viable que puede haber en la composición farmacéutica. Si se desea, después puede filtrarse una solución de lavado, por ejemplo, para lavar los inhibidores de crecimiento, inhibidores metabólicos o inhibidores de detección de la membrana, y así facilitar la detección de microorganismos en el filtrado. Las membranas de filtro que contienen el filtrado se colocan en medios sólidos de cultivo para producir al menos tres cultivos de filtrado. Los cultivos de cultivos de filtrado se cultivan después bajo tres condiciones diferentes: condiciones aeróbicas a 2-25 °C, condiciones aeróbicas de 3-35 °C y condiciones anaeróbicas de 3-35 °C durante un periodo de cultivo suficiente para permitir microorganismos viables que están en la membrana de filtro para proliferar o producir una cantidad suficiente de una biomolécula, tal como adenosín trifosfato, para permitir la detección del microorganismo. Generalmente, los cultivos de filtrado se cultivan durante un periodo no superior a aproximadamente 13 días, y preferentemente se cultivan durante un periodo que es sustancialmente inferior a 13 días. Después, los cultivos de filtrados se evalúan para la presencia de una célula de microorganismo, micro-colonia o colonia viable en una membrana usando cualquier método adecuado. La presencia de una célula de microorganismo, micro-colonia o colonia viable en la membrana de filtro indica la presencia de un microorganismo viable en la composición farmacéutica.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para pruebas de esterilidad de una composición farmacéutica líquida, que comprende las etapas de proporcionar una composición farmacéutica filtrable, filtrar la composición para proporcionar al menos tres membranas de filtro sobre las que se depositan el filtrado, colocar las tres membranas en medios sólidos de cultivo para producir tres cultivos de filtrado, cultivando un primer cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas a 2-25 °C, cultivando un segundo cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas de 3-35 °C y cultivando un tercer cultivo de filtrado bajo condiciones anaeróbicas de 3-35 °C durante un periodo de cultivo no superior a 13 días, y detectar adenosín trifosfato (ATP) en la membrana. La presencia de ATP en una membrana de filtro indica la presencia de un microorganismo viable en la composición farmacéutica.

Usando la invención puede detectarse una amplia variedad de microorganismos (por ejemplo, levaduras y mohos, bacterias gram-positivas esporulantes, bacterias gram-negativas, cocos gran-positivos y bacilos gram- positivos (tanto microorganismos aeróbicos como anaeróbicos). El método puede usarse para detectar cepas de ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo), y también para detectar microorganismos ambientales que puedan contaminar las instalaciones de fabricación. Por ejemplo, como aquí se describe, el método puede usarse para detectar Aspergillus brasiliensis ATCCC 1644 (anteriormente conocida como Aspergillus niger), Bacíllus subtilis ATCC 6633 , Candida albicans ATCC 1231, Clostridium sporogenes ATCC 11437, Pseudonomas aeruginosa ATCC 927, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, Acinetobacter lwoffi, Bacillus clausii, Bacillus idriensis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus,Bacillus sphaericus, Corynebacterium afermetans; Kocuria spez., Kocuria rhizophilia (anteriormente conocida como Micrococcus luteus), Moraxella osloensis, Penicillium spez., Propionibacterium acnés, Staphyloccus capitis, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus warneri.

Generalmente, la composición farmacéutica (por ejemplo, composición farmacéutica líquida) se filtra a través de una membrana estéril de filtro o técnica aséptica bajo presión, tal como usando un vacío o presión positiva. Puede usarse cualquier membrana de filtro adecuada y dispositivo de filtro. Ejemplos de membrana de filtro adecuada incluyen, por ejemplo, una membrana de polivinildenofluoruro, membrana de fibra de vidrio, membrana de policarbonato, membrana de tereftalato de polietileno, ásteres mezclados de celulosa (acetato de celulosa y nitrato de celulosa), membrana de fosfocelulosa, membrana DEAE, membrana de red de nylon o membrana de politetrafluoroetileno. Preferentemente, la membrana está hecha de PVDF (fluoruro de polivinilideno). La membrana

de filtro adecuada para su uso en la invención reivindicada tiene un tamaño de poro que es suficientemente pequeño para mantener a los microorganismos que puedan estar presentes en la composición farmacéutica, tal como un tamaño de poro de aproximadamente ,1 micrones (pm) a aproximadamente 2 micrones, desde aproximadamente ,1 micrones a aproximadamente 15 micrones, desde aproximadamente ,1 micrones a aproximadamente 12 micrones, desde aproximadamente ,1 micrones a aproximadamente 1 micrones, desde aproximadamente ,1 micrones a aproximadamente 8 micrones, desde aproximadamente ,1 micrones a aproximadamente 6 micrones, desde aproximadamente ,1 micrones a aproximadamente 5 micrones, ,4 micrones - 12 micrones, ,4 micrones - 1 micrones, ,4 micrones - 8 micrones, ,4 micrones - 6 micrones, aproximadamente ,22 micrones o aproximadamente ,45 micrones. Preferentemente, el filtro de membrana tiene un tamaño de poro de aproximadamente ,45 micrones.

Generalmente se preparan al menos tres membranas de filtro que contienen filtrado. Esto puede realizarse filtrando tres muestras separadas de la composición farmacéutica a través de tres membranas separadas de filtro. Esto puede realizarse preparando una membrana de filtro que contiene un filtrado de de composición farmacéutica y cortando o dividiendo el filtrado, usando una técnica estéril o aséptica, en tres porciones (por ejemplo, tres porciones de aproximadamente igual tamaño). Las membranas de filtro que contienen el filtrado de composición farmacéutica se colocan después en un medio sólido adecuado de cultivo para producir los cultivos de filtrado.

Pueden seleccionarse adecuado medios sólidos de cultivo y condiciones de cultivo que permitan el crecimiento y/o metabolismo de un microorganismo deseado que se detectará. Esto puede realizase, por ejemplo, analizando medios de cultivo, como aquí se describe y ejemplifica. Preferentemente, los medios sólidos de cultivo usados en el método permitirán el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos bajo condiciones de cultivo aeróbicas y anaeróbicas. Si se desea, puede usarse más de un medio sólido de cultivo. Por ejemplo, puede usarse un primer medio de cultivo que sea equivalente o mejor a caldo de soja tríptico para crecimiento de levaduras, mohos y bacterias aeróbicas; puede seleccionase un segundo medio de cultivo que sea equivalente o mejor a la fase anaeróbica de medio tioglicolato fluido para crecimiento de microorganismos aeróbicos. Preferentemente, se usa un único medio sólido de cultivo bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Medios sólidos adecuados de cultivo que pueden usarse en la invención incluyen, por ejemplo, MTF-A (medio tioglicolato fluido que contiene 1,75% agar (concentración final)), ICC (agar de infusión de cerebro y corazón), agar anaeróbico Brewer Difeo, agar R2A, agar de sangre de Schaedler, agar-caso ICR (agar de soja tríptico), agar Columbia 5% sangre, y agar de sangre anaeróbico CDC. Agar de sangre... [Seguir leyendo]

1. Un método para pruebas de esterilidad de una composición farmacéutica líquida que comprende:

(a) proporcionar una composición farmacéuticamente filtrable;

(b) filtrar la composición farmacéutica para proporcionar al menos tres membranas de filtro sobre las cuales se deposita el filtrado de la composición farmacéutica;

(c) colocar al menos las tres membranas de filtro en medios sólidos de cultivo para producir al menos tres cultivos de filtrado;

(d) cultivar (i) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas a 2-25 °C; (ii) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas de 3-35 °C; y (iii) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones anaeróbicas de 3-35 °C; con la condición de que ninguno de los cultivo de filtrado se cultive durante un periodo superior a aproximadamente 13 días y

(e) detectar una célula de microorganismo, micro-colonia o colonia viable en una membrana, donde la presencia de una célula de microorganismo, micro-colonia o colonia viable en la membrana indica la presencia de un microorganismo viable en la composición farmacéutica.

2. El método de la reivindicación 1, donde (b) además comprende filtra una solución de lavado después de que la composición farmacéutica se haya filtrado.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2 donde la(s) membrana(s) es/son una membrana de polivinilidenofluoruro, membrana de fibra de vidrio, membrana de poli carbón ato, membrana de tereftalato de polietileno, éteres mezclados de celulosa (acetato de celulosa y nitrato de celulosa), membrana de fosfocelulosa, membrana DEAE, membrana de red de nylon o membrana de politetrafluoroetileno.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la(s) membrana(s) tiene/tienen un tamaño de poro de aproximadamente ,45 pm.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el medio sólido de cultivo se selecciona del grupo consistente en MTF-A (medio tioglicolato fluido que contiene 1,75% agar (concentración final)), ICC (agar de infusión de cerebro y corazón), agar anaeróbico Brewer Difeo, agar R2A, agar de sangre de Schaedler, agar-caso ICR (agar de soja trípitico), agar Columbia 5% sangre, y agar de sangre anaeróbico CDC.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde en (d) los cultivos de filtrado se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para la producción de una cantidad detectable de adenosín trifosfato.

7. El método de la reivindicación 6, donde los cultivos de filtrado se cultivan durante un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 días.

8. El método de la reivindicación 7, donde los cultivos de filtrado se cultivan durante un periodo de 5 días.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde en (e) una células de microorganismo, micro-colonia o colonia viable se detecta usando un ensayo de luminiscencia.

1. El método de la reivindicación 9, donde el ensayo de luminiscencia: (i) detecta adenosín trifosfato producido por un microorganismo, micro-colonia o colonia viable en la membrana; (ii) comprende un ensayo de luciferasa; o (iii) detecta un producto de hibridización de ácido nucleico formado entre una sonda y un ácido nucleico endógeno a un microorganismo, que comprende por ejemplo una reacción de peroxidasa.

11. El método de la reivindicación 9 o 1, donde se detecta luminiscencia usando una cámara con dispositivo cargado acoplado y software de análisis de imágenes.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se realiza en un sistema de detección de microbiología rápido que comprende una estación de preparación de muestra, una estación de auto-pulverización, una torre de detección, una analizador de imágenes, una cámara CCD y un ordenador con software.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la composición farmacéutica es una composición parenteral, una composición oral, una composición nasal, o una composición ocular.

14. El método de la reivindicación 13, donde la composición farmacéutica es una vacuna, por ejemplo, seleccionada del grupo consistente en vacuna de ántrax; vacuna de tuberculosis; vacuna de Borreliosis; vacuna de toxoide de difteria y toxoide de tétanos; vacuna de toxoide de difteria y toxoide de tétanos y pertussis; vacuna de toxoide de difteria y toxoide de tétanos y pertussis acelular; vacuna de toxoide de difteria y toxoide de tétanos y pertussis acelular y Haemophilus influenzae tipo b conjugado; vacuna de toxoide de difteria y toxoide de tétanos y pertussis acelular y Haemophilus influenzae tipo b conjugado y poliovirus inactivado; vacuna de virus de hepatitis A; vacuna de virus de hepatitis A y hepatitis B; vacuna de virus de hepatitis B; vacuna de Helicobater pylori; vacuna de

Haemophilus influenzae tipo b; vacuna de virus de influenza; vacuna de poliovirus; vacuna meningocócica (Neisseria meingitidis); vacuna del virus de sarampión, virus de paperas, virus de rubéola; vacuna del virus de sarampión, virus de paperas, virus de rubéola y virus de varicela; vacuna neumocócica (Streptococcus pneumoniae)', vacuna de rabia; vacuna de virus sincitial respiratorio; vacuna de viruela; vacuna de toxoplasmosis (Toxoplasma gond¡¡)\ vacuna tifoidea (Salmonella typh¡)\ vacuna de tuberculosis (Mycobacteríum tuberculosis)', vacuna de varicela (varicela, virus de varicela zóster); y preferentemente donde dicha vacuna es una vacuna de gripe aviar o vacuna de gripe porcina.

15. Un método para pruebas de esterilidad de una composición farmacéutica líquida que comprende:

(a) proporcionar una composición farmacéuticamente filtrable;

(b) filtrar la composición farmacéutica para proporcionar al menos tres membranas de filtro sobre las cuales se deposita el filtrado de la composición farmacéutica;

(c) colocar al menos las tres membranas de filtro en medios sólidos de cultivo para producir al menos tres cultivos de filtrado;

(d) cultivar (i) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas a 2-25 °C; (¡i) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones aeróbicas de 3-35 °C; y (iii) al menos un cultivo de filtrado bajo condiciones anaeróbicas de 3-35 °C; con la condición de que ninguno de los cultivo de filtrado se cultive durante un periodo superior a aproximadamente 13 días y

(e) detectar adenosín trifosfato (ATP) en la membrana, donde la presencia de ATP en una membrana indica la presencia de un microorganismo viable en la composición farmacéutica.